结核杆菌对异烟肼药物的敏感性试验

【摘要】 目的研究结核分枝杆菌对异烟肼药物的敏感性状况，为结核病的防治提供理论依据。方法 采用直接涂片检查法和培养法。对肺结核患者的痰液进行检查，阳性标本经抗酸染色镜检确认后，采用绝对浓度法的间接法进行耐药性测定。结果 131例疑似肺结核患者痰标本中，直接涂片法检出阳性标本21例，阳性检出率为16．0%（21/131）；培养法共检出阳性标本56例，阳性检出率为42．7%（56/131）。比较2种检测方法的阳性检出率，差异有统计学意义（P<0．05）。培养法高于直接涂片法。56株结核杆菌标本进行异烟肼的药物敏感性试验，其中有47株发生耐药，耐药率为83．9%，且都是高浓度耐药。结论 结核分枝杆菌对异烟肼的初始耐药率处于较高水平，必须进一步加强对耐药结核杆菌的监控。

【关键词】 结核分枝杆菌；异烟肼；药敏试验

The study on the primary drug resistance against isoniazid for tubercolusis

WANGBao-guo,CHENSi-dong,ZHOU Wei-ping , et al．

Guangdong Pharmaceutical University , Guangdong 510006,China

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【Abstract】 Objective To study the situation and trend of isoniazid resistance for tuberculosis and provide the basis for tuberculosis prevention and treatment. Methods Sputum fluid was examined by direct smear and culture on modified lowenstein-jensen medium after treatment with 4% NaOH. Then the positive samples were subjected to susceptibility testing against isoniazid using absolute concentration method. ResultsThe positive rate with culturing and smearing method was 42．7%（56/131）, and the positive rate with direct smearing method was 16．0%（21/131）. The prevalence of primary drug resistance was 83．9%(47/56), and at high concentration level.ConclusionThe rate of primary drug against Isoniazid still to be at a higher level. Monioring of the resistance of tuberculosis should be strengthened.

【Key words】 Mycobacterium tuberculosis; Isoniazid; Drug resistance analysis

结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌感染引起的人畜共患的严重传染病，也是人类单一致病菌感染导致死亡率最高的细菌感染性疾病。结核病的发病率及死亡率在全球范围内均有上升的趋势而且由于获得性免疫系统缺陷综合征-艾滋病的流行，在非洲、美洲许多国家及某些亚洲国家出现结核杆菌和艾滋病毒双重感染的患者，这是结核病第3次回升的新动向。WHO预测，若不采取有效措施，未来的十年中，全球将有3000多万人死于结核病^[1]。

结核病是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题，世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一。全球80%的结核病患者分布在22个结核病高负担国家，中国是其中之一，结核病患者数仅次于印度居世界第2位^[2]。但是，近10年来，临床上发现抗结核药物的耐药性对结核病化疗效果的影响日益严重，结核病患者由于受到耐药性结核分枝杆菌的感染，使本来容易治愈的疾病变为难治性疾病甚至导致化疗失败^[3]。

耐多药结核菌株的增加，给结核病的防治带来了极大的困难。耐多药结核杆菌的产生是由于不规范的治疗和控制方法引起。理论上耐多药菌株的出现可由细菌对耐单药的逐一获得而形成，也可有表现为多价作用的单基因突变而造成。临床上已证实耐单药的形成是由于不合理治疗所致，同时也强有力支持耐单药的顺次获得是形成耐多药的最可能机制。因此合理进行临床治疗极为关键。正确的药敏试验结果是指导临床合理用药的前提，所以药敏试验在结核病防治中有极重要的作用^[4]。

为了解广州地区结核杆菌对异烟肼耐药的状况，为临床合理、联合用药提供依据，特作本研究。现将结果报告如下。

1 资料和方法

1．1 病例来源 2005年11月至2006年5月间，在广州市白云区某医院、深圳市宝安区某医院检查为疑似肺结核患者的痰液，共131例。病例发病前均未服用过抗结核药物。结核分枝参考菌株为H37Rv敏感株，由中国结核病防治临床中心国家参比实验室提供。

1．2 痰液直接涂片法 用接种环取脓性痰1～2环，均匀涂于载玻片上，待自然干燥，微火焰固定，抗酸染色镜检。

1．3 分枝杆菌培养法 

1．3．1 培养基 为酸性罗氏培养基。成分：谷氨酸纳(纯度95%以上) 7．2 g, KH₂PO4 14 g,MgSO4•7H₂0 0．24 g, 枸椽酸镁 0．6 g,甘油12 ml,蒸馏水600 ml,马铃薯淀粉 30 g,新鲜鸡卵液1000 ml,2%孔雀绿水溶液 20 ml。

1．3．2 制备方法 各种盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴煮沸1 h呈糊状(不时摇动，防凝块)，待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀，再加入2%孔雀绿水溶液，混匀，分装于经121℃高压灭菌的中型试管，每管加培养基7 m1，斜置血清凝固器内1～2层，斜面高度占试管2/3,90℃ 1．5 h或85℃ 1 h间歇2次。冷却后，37℃无菌试验24 h。培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡，有一定韧性和酸碱缓冲能力,4℃保存，1个月内使用。

1．3．3 接种方法 取痰标本1～2 ml，加入2倍量4%NaOH，于室温下放置30 min（期间振荡2～3次）后，取前处理消化后痰液0．1 ml，无菌操作接种于培养基斜面上，每份标本同时接种两支酸性改良罗氏培养基，放37℃恒温箱培养。每周观察1次,记录细菌生长情况，至8周为止。

1．4 药敏试验 具体操作参照结核病诊断细菌学检验规程^[5]。

1．4．1 药物 异烟肼为纯品，结晶状。由上海楷洋生物技术有限公司提供。

1．4．2 培养基 为改良罗氏培养基。成分：谷氨酸钠（纯度95%以上）7．2 g；磷酸二氢钾2．4 g；硫酸镁0．24 g；枸橼酸镁0．6 g；丙三醇12 ml；蒸馏水600 ml；马铃薯淀粉30 g；新鲜鸡卵液1000 ml；2%孔雀绿水溶液20 ml^[5]。

1．4．3 制备方法 制备方法同酸性罗氏培养基。只是在培养基制成后分装试管之前，按每100 ml培养基加入1 ml异烟肼药液，混匀，再行分装中型试管，加温凝固成斜面^[5]。

1．4．4 异烟肼药液的配制 异烟肼药物为纯品，生物效价为1000 μg/mg，配制2个浓度的含药培养基，药物浓度为：1、10 μg/ml，根据标本例数，每支试管含培养基7 ml，计算所需培养基的量，再得出所需药物量。每100 ml的培养基加入1 ml的药液。所得培养基即为含药培养基^[5]。

1．4．5 菌悬液的制备 取在酸性罗氏培养基生长旺盛的2~3周的菌落，用磨菌器仔细研磨成乳液样菌液、以0．5%Tween-80生理盐水稀释至1 mg/ml的均匀菌液，备用。

1．4．6 接种 将菌悬液10倍稀释至10-2 mg/ml，取0．1 mg接种于含药及对照培养基内，37℃培养，培养2周报告结果^[5]。

1．4．7 质量控制 每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株（H37RV敏感株）10-5 mg检测含药培养基质量。

1．4．8 结果判定 经培养对照，培养基菌落>200个且无融合，含药培养基上无生长为（-），并可报告敏感；含药培养基菌落数<20个则实报菌落数；含药培养基上菌落生长数占斜面1/4为（+）；占1/2为（++）；占1/3为（+++）；菌落布满整个斜面为（++++），均可报告低度耐药或高度耐药。对照培养基的菌落数在50~200个时需重复试验^[5]。

1．5 统计学方法 两种检测法阳性检出率的比较χ²检验，以P<0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 痰涂片情况 131例疑似肺结核患者标本中，共有21例痰涂片为阳性。阳性率为16．0%。

2．2 痰培养结果 131例标本中，有菌生长60例，经抗酸染色镜检后，共有56例为结核分枝杆菌，阳性检出率为42．7%。结果见表1。

2．3 药敏试验结果 质控H37Rv生长结果：对照培养基为4+，高、低浓度含药培养基均不生长，为敏感。故所配制的培养基质量合格，能用于药物敏感性测试。

56株痰培养阳性标本中，其中47株的对照培养基全部生长，菌落数均在200以上无融合。故56例试验标本中共有47例出现耐药，总耐药率为83．9%，并且所有耐药菌株均为高浓度耐药。见表2。

3 讨论

耐药性试验不仅是临床选择和评价化疗方案的依据，更是流行病学的重要指标^[6]。我国1990年流调初始耐药率为异烟肼9．6%。近年来，结核分枝杆菌异烟肼耐药性呈上升趋势，美国纽约的结核分枝杆菌临床分离株中，26%对异烟肼耐药，我国异烟肼初始耐药率为28．1%，继发耐药率为41．1%。本研究中的异烟肼敏感性试验初始耐药率为83．9%，其原因除化疗管理不足外，不排除其中的未被发现的获得性耐药菌株的影响。如此高的初始耐药率，严重地削弱化学治疗效果^[7]。更说明了本地区结核病耐药情况严重，应引起警惕。

异烟肼是酰肼类化学合成药物，抗菌作用强，试管内对结核分支杆菌和牛分支杆菌的敏感范围为0．02～0．2 μg/ml。高于现有各种抗结核药物，且其在组织内渗透能力强，能快速转运至菌体内，在干酪病变内充分扩散。自1952年异烟肼首次用于结核病的临床治疗以来，一直作为抗结核治疗的首选药物，至今已有50多年的历史^[4]。而对异烟肼的耐药意味着一方面由于患者对异烟肼耐药，临床上须加大药剂量或改用其他抗结核药物，使患者的疗程延长，增加患者的危险和经济负担；另一方面也加大了耐药性结核杆菌传播的机会，使人群暴露于耐药结核杆菌的危险性增加^[8]。

研究表明，结核杆菌对异烟肼产生耐药性是由于编码过氧化氢-过氧化物酶(该酶能激活INH药物前体)的KatG基因突变和编码参与分枝菌酸合成的enoy1-ACP还原酶(该酶为INA活化形式作用的靶位)的inhA基因突变所致^[9]。由于结核分枝杆菌产生自然耐药变异的频率很低，造成耐药的主要原因是治疗过程中不合理的联合用药、间断用药、不执行归口管理与治疗等。因此，在今后的结核病防治工作中，重点为社会性综合防治措施，抓好结核患者的发现、登记、管理和合理治疗。坚持在直接面视短程化疗(DOTS)下^[10]，早期、适量、规律、全程、联合应用敏感药物或抗结核药物复合剂，辅以免疫剂治疗，使得在强化期内迅速、大量杀灭结核菌，使痰菌转阴^[11]。对于耐药病例防治，须坚持联合用药的原则，根据既往用药史和药物敏感性试验制定个体化治疗方案。结核病防治部门也应加强对耐药菌株的检测，掌握结核病耐药趋势，以指导临床合理、有效用药^[3]。针对本研究中的高耐药率，应优先使用抗结核药物复合剂，辅以免疫剂治疗,以提高结核病治疗的有效率，达到控制结核病的目的。

参考文献

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［2］ Donald AE, Hans LR, Thuridur A, et al. Manage-ment of tuberculosis, a guide for low income countries.Union Against Tuberculosis and Lung Disease,2000:3-5.

［3］ 刘传玉.结核病现代防治.河南科学技术出版社,2002:492-498.

［4］ 张敦熔.现代结核病学.人民军医出版社,2000.

［5］ 中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程.中国防痨杂志，1996，18(1):30.

［6］ 彭卫生,王英年.肖成志.新编结核病学.北京:中国医药科技出版社,2003:136-139 

［7］ 那希宽,黄子青,毕志强. 分支杆菌对临床抗结核药物敏感性试验报告.全国第二届结核分枝杆菌病研究讨会资料汇编，1993.

［8］ 屠德华.耐药性结核病的流行病学特征和意义.中华结核和呼吸杂志1997，20（16）:327.

［9］ 张建芳,段艳,苏明权.结核分枝菌临床分离株耐药特点分析.西北国防医学杂志,2004,25(3):195-196.

［10］ 张舒华.肺结核流行趋势及控制策略综述.安徽预防医学杂志,2005,11(1):30-32.

［11］ 谢惠安,阳国太,林善梓,等.现代结核病学.北京:人民卫生出版社,2000：93-98.

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