11周龄硝酸甘油大鼠模型表面效度研究

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[摘要] 目的 本研究旨在11周龄硝酸甘油偏头痛模型大鼠头痛行为学的基础上结合临床偏头痛的头痛症状学对偏头痛大鼠模型的表面效度进行研究。 方法 根据体重及基础痛阈将36只大鼠随机分成四组，即正常组、模型组、西药组（苯甲酸利扎曲普坦）、中药组（川芎-天麻），每组9只。造模后，用高清摄像头记录大鼠行为学2 h。通过空白对照和药物反证治疗进行系统评价。 结果 造模后2 h内，模型组爬笼及理毛次数少于正常组，挠头次数多于正常组。西药组及中药组挠头次数少于模型组。 结论 挠头次数可以作为评价偏头痛大鼠模型表面效度的核心内容及判断药物疗效的指标。同时发现，11周龄偏头痛大鼠行为可能与人类偏头痛症状更相近。

[关键词] 偏头痛；硝酸甘油；表面效度；周龄

[中图分类号] R747.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）25-0033-04

Study on the surface validity of 11-week-old nitroglycerin rat model

ZHOU Huixia1，2 ZHANG Zhengxiang3 CHEN Qiang3 KONG Minlu4 DENG Yu1 CHENG Jing1 HOU Qun3 SHAO Minfeng1

1.No.1 School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China； 2.Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， No.1 School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Provincial Hospital of TCM， Hangzhou 310006， China； 3.Zhejiang Xiaoshan Hospital， Hangzhou 311202， China； 4.Hangzhou Geriatric Disease Hospital， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To study the surface validity of migraine rats on the basis of the headache behavioral science of 11-week-old nitroglycerin migraine rate model combined with the symptomatology of clinical migraine. Methods 36 rats were randomly divided into 4 groups according to body weight and basic pain threshold， namely normal group， model group， Western medicine group（Rizatriptan）， and traditional Chinese medicine group（ligusticum wallichii-gastrodia elata）， with 9 rats in each group. After modeling， the behavior of rats was recorded by high-definition camera for 2 hours. A systematic review was conducted by blank control and drug counterevidence therapy. Results Within 2 hours after modeling， the frequency of climbing cage and grooming in the model group was less than that in the normal group， and the frequency of scratching head was more than that in the normal group. The frequency of scratching head in the Western medicine group and Chinese medicine group was less than that in the model group. Conclusion Scratching head can be used as the core content of evaluating surface validity of migraine rats and the index of judging drug efficacy. At the same time， the behavior of 11-week-old migraine rats are found to be more likely to be associated with human migraine symptoms.

[Key words] Migraine； Nitroglycerin； Surface validity； Week age

偏頭痛是一种常见的慢性神经血管性疾病，我国患病率为9.3%[1]，好发于中青年，40岁[2]达最高峰，40岁后发病率开始下降。2013年全球疾病负担调查的研究结果表明偏头痛为人类第三位常见疾病，按失能所致生命年损失（years of life lost to disability，YLDs）计算，偏头痛为第六位致残性疾病[3]。硝酸甘油模型具有操作简单、机制单一、短时间内可大量复制等优点，且其行为学表现及病理生理变化与人类发病时的表现及变化相似，因此被广泛应用于偏头痛相关课题的研究。本研究选用11周龄[4，5]大鼠通过视频录像方法对硝酸甘油大鼠模型行为学进行系统评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠36只，体重（300.81±10.84）g（浙江省实验动物中心，许可证号SCXK（浙）20140001），浙江中医药大学动物实验中心提供。分笼饲养于浙江中医药大学动物实验中心。实验时间：2015年2～5月。

1.2 药品及试剂

苯甲酸利扎曲普坦（批号140404），湖北欧立制药有限公司生产；川芎（1403158），天麻（1404046）江阴天江药业有限公司生产；硝酸甘油注射液（批号20131223），北京益民药业有限公司生产；0.9%NaCl溶液（F1412033），杭州民生药业有限公司生产。西药组及中药组均用超纯水定容稀释。

1.3主要仪器设备

Nanopure UV/UF综合分析型超纯水系统（D11931），美国BARNSTEAD公司生产；电子天平（CP213），奥豪斯仪器（上海）有限公司生产；松下高清摄像机（HC-V210M），松下电器（中国）有限公司生产；数显鼠光热测痛仪（JD-A）：上海继德教学实验器械厂生产。

1.4 造模

36只健康SD雄性大鼠经过7 d的适应性饲养，先予两次甩尾试验，取均值，即基础痛阈。动物按体重及基础痛阈随机分成四组：正常组、模型组、西药组、中药组，每组9只，组间均衡。正常组及模型组均予超纯水灌胃（给药体积：1 mL/100 g）；西药组予苯甲酸利扎曲普坦溶液灌胃（给药剂量：0.816 mg/kg，给药体积：1 mL/100 g）；中药组予川芎-天麻溶液灌胃（给药剂量：2449 mg/kg，给药体积：1 mL/100 g）。各组动物共灌胃7 d，每天1次。

以上四组中除正常组外，其余各组在完成第7天灌胃后0.5 h，进行硝酸甘油造模，即腹腔注射硝酸甘油（给药剂量：10 mg/kg，给药体积：0.2 mL/100 g），正常组予腹腔注射0.9%生理盐水（给药体积：0.2 mL/100 g）进行对照。第7天造模前测得所有SD大鼠体重为（360.36±13.35）g（相当于11周龄[4，5]）。

1.5 行为学观察

注射完成后立即进行大鼠行为学观察，并用高清摄像机进行记录，共计2 h，统计造模后2 h内各行为出现的次数。主要观察以下3个行为学症状。①爬笼：双前爪离地搭于桶壁上或腾空站立为爬笼。②理毛：大鼠用嘴舔舐爪子及身上的毛，或用前后爪搔抓头面部以外区域的毛。③挠头：大鼠使用前爪或后爪迅速搔抓头面部，连续挠计为一次，若中间有停顿或者夹有其他动作，则计为两次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，计数资料采用频数表示。采用Shapiro-Wilk检验法进行正态性检验，正态计量资料以均数±标准差（x±s）表示，非正态计量资料以中位数（四分位间距）表示。方差齐性者比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用SNK法；方差不齐者比较采用非参数检验的Kruskal-Wallis法，其中两两比较采用所有成对比较（all pairwise multiple comparisons）法。各组资料均以α=0.05为显著性水平。

2 结果

2.1各组大鼠体重变化

干预前，各组大鼠基础体重无统计学差异。第1天，正常组大鼠体重较模型组低，差异有统计学意义（P=0.007，P<0.01），西药组大鼠体重较模型组高，差异有统计学意义（P=0.027，P<0.05），第2天到第6天模型组与其余各组大鼠体重相较无统计学差异（P>0.05）。提示中、西药对体重无明显影响。见表1。

2.2 行为学结果

造模后2 h内，正常组大鼠始终活动自如，模型组、西药组、中药组大鼠在造模后5 min左右开始出现活动减少及倦怠表现。其中模型组的爬笼及理毛次数[0（2.5），1（3.5）]明显少于正常组[43（24），13（5.5）]，差异有统计学意义（P爬笼=0.000，P理毛=0.000，P<0.01），而模型组挠头次数[1（3）]则多于正常组[0（0）]，差异均有统计学意义（P=0.002，P<0.01），表明造模成功。西药组及中药组挠头次数[0（0.5），0（0.5）]少于模型组[1（3）]，差异均有统计学意义（P西药组=0.042，P中药组=0.031，P<0.05），表明西药与中药均有一定治疗效果，见表2。

3 讨论

偏头痛模型广泛应用于偏头痛发病机制及临床新药的研究，观察指标多种多样。目前最常用的是热及机械痛阈值测定，用von Frey纤维丝测定足底或者面部、眶周疼痛敏感性，热板实验、甩尾实验、Hargreaves测定法[6]等测定热敏感性。但由于痛觉超敏延迟发生[6]，Tassorelli C等[7]研究发现硝酸甘油在给药后2～4 h诱导痛觉过敏，所以测量时效性及准确性难以把握。而且虽然有近2/3偏头痛患者有异常性疼痛[8]，但异常性疼痛不是偏头痛的诊断标准。Jones MG[9]等通过肌电图定量测定响应于角膜空气气泡引起的眼轮匝肌眨眼反射的强度，间接记录硝酸甘油引起的三叉神经通路的激活。另外還有大鼠面部痛苦表情量表（RGS）测定面部动作[10]、光暗盒或者高架十字迷宫等测定畏光行为。但这些特征表现只存在于偏头痛部分亚型。

偏头痛的主要诊断依据是疼痛，而疼痛是一种生物感觉，是发生在清醒状态下的、有行为反应的感觉，所以研究偏头痛模型与疼痛相关的表面效度更具说服力。表面效度是指动物模型中动物与人类之间现象学的相似性，即症状同源性。对于偏头痛模型来讲，表面效度就是指能够多大程度上反映人类偏头痛的客观行为指标。目前判断偏头痛模型的行为学标准仍未统一，因此建立较好的表面效度至关重要，但同时又存在一定的困难，原因有：个别指标与临床表现不符；判断的个人主观性较强；指标过于单一等。

硝酸甘油作为NO的前体，通过激活血管平滑肌细胞内鸟苷酸环化酶扩张血管诱发头痛的发生，参与疼痛的激发与维持[11]。硝酸甘油模型具有操作简单、机制单一、经济、短时间内可大量复制等优点，且其清醒时的行为学表现与患者临床癥状一致性较高，可较直观反映疼痛的发生，故本研究选用了该造模法。

硝酸甘油偏头痛大鼠的行为学目前主要有耳红、爬笼、理毛、挠头等，目前多数研究[12-15]发现大鼠在造模后即出现烦躁不安，表现为耳红、爬笼、挠头次数增多、过度理毛等，他们认为这些行为学表现与临床患者烦躁不安、易激惹表现相似，可解释为由焦虑情绪引起的自主活动增多。但李涛等[16]发现腹部皮下注射硝酸甘油的大鼠一开始表现自如，3～5 min后出现精神不振、反应迟钝。姜维等[17]、王克柱[18]研究发现偏头痛造模后起初半小时，模型组较对照组挠头明显增多，爬笼无差异，随后以活动减少、倦怠为主。这与本实验一致。Tassorelli C[19]也认为偏头痛大鼠在发病期间表现为活动减少，不进食饮水。这些表现则与临床患者懒散、疲乏无力、昏昏欲睡等症状相符。以上两种研究结果不一致，于是我们认为评价该模型的行为学指标仍未统一，有待进一步探讨。

Andrews N等[20]研究发现损伤周围神经，表现为先天挖洞行为的明显减少。另外有发现疼痛可以引起实验动物进食减少[21]。已知中脑导水管周围灰质（PAG）调节疼痛的关键部位，Depaulis A等[22]通过药物刺激PAG发现，作为对“深层次”或“不可避免的”疼痛，慢性损伤或失败的反应，动物通常会减少运动，变得更加孤独，对环境的反应减弱。与本研究模型组爬笼、理毛明显减少相一致。也与人类偏头痛患者表现的倦怠乏力相一致，且与偏头痛诊断标准“活动后加重”相呼应。偏头痛的特征是严重的疼痛和对感觉刺激的敏感性增加，导致正常日常活动的抑制。据流行病学调查显示，有大于50%[23]的患者需要卧床休息来治疗偏头痛发作。由此可知，抑制性行为是偏头痛的重要特征之一，同时也是动物对疼痛的普遍反应，并非偏头痛所特有。

本研究发现硝酸甘油偏头痛大鼠模型除理毛、爬笼等日常活动受抑制外，有特征性的挠头行为的增加，且中药组或西药组干预后均明显减少。这与Melo-Carrillo A和Lopez-Avila A[24]的发现部分相一致，他们通过刺激大鼠硬脑膜，发现偏头痛大鼠休息、冻结行为、同侧后爪挠头较对照组明显增多。但不管行为活跃或抑制，上述研究偏头痛模型均有明显增加的行为特征，即挠头。该行为是对主观疼痛感直接且客观的反应，与临床患者的头痛症状相符，故我们有理由认为挠头可作为判断模型成功的核心指标。

偏头痛好发于中青年，40岁[2]达最高峰，40岁后发病率开始下降。从分子生物学角度阐释，Fan PC等[25]研究发现青春期大鼠和成年期大鼠有相当的三叉神经根颈部复合体（TCC），但三叉神经血管系统（TGVS）的外周反应性比成人差，有年龄依赖性差异。故实验大鼠年龄的选取与偏头痛结局明显相关。本实验第7天造模前测得所有SD大鼠体重为（360.36±13.35）g（相当于大鼠11周龄[4，5]），目前大部分偏头痛动物模型的研究选取的大鼠体重在200～300 g（相当于7～8周龄大鼠[4，5]）。因此部分研究表现为行动活跃，可能与青少年大鼠发病率低，三叉血管系统外周反应差，尚构不成典型的偏头痛模型有关。不过目前这些只是猜测，尚需要实验进一步论证。为了能尽量客观地评价模型大鼠的行为学，本研究采用高清摄像机进行全程录制，以便后期可以重复进行评价，增加行为学评价的准确性。另外，在指标的选择上，我们考虑到行为学指标的易观察性、可量化性等因素，最终将爬笼、理毛、挠头作为观察指标。结果显示，模型组挠头次数明显多于正常组，与既往的研究结果均相符合，同时又是对疼痛的直接反映，因此，我们认为挠头可作为评价偏头痛模型行为学的核心指标之一。

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