鸡新城疫血凝和血凝抑制试验实训实习效果分析

摘要[目的] 对某养鸡场的鸡新城疫抗体进行血清学检测，以有效评估鸡群的免疫状态，制定合理免疫程序。[方法] 对永州市某养鸡场病鸡进行鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验，检测鸡新城疫抗体水平。[结果]在检测的60份血样中鸡新城疫抗体效价为1∶8～1∶4。鸡新城疫抗体效价≥1∶16（4log2）的占13.3%，鸡新城疫抗体效价≥1∶8（3log2）的占21.7%，鸡新城疫抗体效价<1∶4（2log2）的占65%。[结论] 该鸡场鸡群鸡瘟疫苗免疫失败。

关键词鸡新城疫标准抗原；血凝试验；血凝抑制试验

中图分类号S852.65+7文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05881-02

永州市某养鸡场共饲养1 500只40日龄鸡，已进行鸡瘟疫苗免疫，2013年11月先后出现精神萎靡、不食、下痢等症状，有少量死亡现象，用抗生素治疗无效。剖检发现在腺胃处有轻微出血点，其他内脏器管无明显变化。笔者对病死鸡进行了鸡新城疫抗体水平检测。

1材料与方法

1.1仪器与设备高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2 mm聚乙烯塑料管、酒精灯、注射器（2.5 ml）、96孔V型微量凝集试验板、0.025 mm微量吸液器、微型振荡器、恒温培养箱、微量移液器、脱脂棉等。

1.2药剂生理盐水、3.8%柠檬酸钠抗凝剂、1%鸡红细胞悬液为实验室自制。鸡新城疫标准抗原、阳性血清，均购自中国农业科学院兽医研究所。

1.3血样采集要求每个学生随机抽样，鸡翅下静脉采血，每只2 ml，共采集血样60份，置于冰盒中2 h内带回实验室。

1.4样品的处理

1.4.11%红细胞悬浮液的配制[1]。鸡翅静脉或心脏采血10 ml，并与柠檬酸钠抗凝剂充分混匀后，取5 ml血样和95 ml生理盐水共同加入2个大离心管中，2 000 r/min离心5 min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞中加入稀释液（生理盐水）洗涤。然后，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，以上操作重复3～4次。操作结束后，以微量加样枪吸取5 μl的红细胞加入495 μl生理盐水中，充分混匀，即制成1%红细胞悬浮液。

1.4.2待测血清的制备。用一次性注射器在鸡翅下静脉采血，注入内径2～3 mm塑料管，在室温下静置或离心，待血清析出后使用。每只鸡应更换1个注射器，严禁交叉使用。

1.5病毒的血凝（HA）试验采用微量法进行血凝试验。试验前需先测定血清有无此凝集特性。如果有凝集特性则需用鸡红细胞对血清进行吸附，以去掉此种非特异性凝集，然后才能用于试验。 ①首先用移液器在V型微量反应板中每个孔加入稀释液1滴（0.05 ml）。②用微量移液器取病毒抗原0.05 ml，加入第1孔，反复抽动6次后，吸出0.05 ml加入第2孔，在第2孔反复抽动6次后，吸出0.05 ml加入第3孔，如此连续稀释至第11孔后吸出0.05 ml弃去。第12孔不添加病毒液作为红细胞空白对照。③换吸头吸取1%鸡红细胞悬浮液依次加入第1～12孔中，每孔加入0.05 ml。④置于振荡器上振荡1～2 min，室温静置（约20 ℃）40 min，或放恒温培养箱37 ℃下作用5～10 min，在对照孔的红细胞显著呈纽扣状时判定结果。

结果判断：HA 判定时，应将反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠样流淌，完全 HA（无泪珠样流淌）的最高稀释倍数作为血凝效价，表示1个HA 单位，再根据初始的稀释倍数计算血凝效价。

1.6红细胞血凝抑制（HI）试验

1.6.14个血凝单位的病毒液的制备。根据HA试验结果确定病毒的血凝价，用生理盐水稀释病毒，使之含4个血凝单位的病毒。

1.6.2血凝抑制（HI）试验。新城疫病毒凝集红细胞的作用，能被特异性抗体抑制。因此，可采用血凝抑制（HI）试验测定鸡血清中的HI抗体效价（滴度），并可用标准血清，进行新分离病毒的鉴定与未知病毒的诊断。采用微量法进行红细胞血凝抑制（HI）试验。

①用移液器向每孔加入0.05 ml稀释液，第11孔加入01 ml。②用移液器吸取被检血清0.05 ml注入第1孔，抽放3～5次后，吸出0.05 ml，注入第2孔，如此连续稀释至第10孔，并从第10孔吸出0.05 ml弃去，第11孔为病毒对照，第12孔为盐水对照。③用移液器吸取已稀释好的4单位病毒液，向第1～11孔中分别加入0.05 ml。④置于振荡器上振荡1～2 min，室温静置（约 20 ℃）40 min，或放入恒温培养箱37 ℃下作用5～10 min。⑤每孔再加入1%红细胞悬浮液0.05 ml，置于振荡器上振荡15～30 s，置于恒温培养箱37 ℃下15～30 min后判定结果。⑥第11孔为红细胞对照孔，第12孔作为抗原对照孔。

结果判断：确定血凝时需倾斜反应板，只有与对照孔红细胞流淌相当的孔才可判定为抑制。结果的正确性应视对照血清而论，阴性对照血清呈阴性，阳性对照血清的效价应符合其已知效价。当HI效价在 1∶16（4log2）或以上时，为阳性；当HI效价为1∶8（3log2）时为阴性。鸡的用途不同，对HI效价的要求也不同，雏鸡与后备鸡HI效价要求在1∶16（4log2）以上，蛋鸡效价要求在1∶32（5log2）以上，种鸡HI效价要求在1∶64（6log2）以上。鸡群免疫合格率在70%以上，则可判定为免疫合格。

2结果与分析

鸡新城疫抗体水平检测结果在所检测的60份血样中，测得其效价范围为2～3log2。从表1可以看出，该鸡场新城疫抗体效价≥1∶16（4log2）的血清占13.3%，抗体效价≥1∶8（3log2）的血清占21.7%，抗体效价<1∶4（2log2）的血清占65%，说明该鸡场鸡群免疫失败。

3讨论

（1）通过这次实训实习使理论与实践相结合，加深了学生对所学知识的理解和运用，加强了专业实践能力的锻炼，也认识到自身的不足之处以及今后的发展方向，体会了畜牧兽医工作的艰辛和畜牧兽医工作者责任的重大、对畜牧兽医工作者职业技能和基本素质有了新的思考和深切体验、为今后走向畜牧兽医工作岗位积累了经验，并做好了心理准备，圆满完成了实训实习任务，为就业和将来的工作取得了一些宝贵的实践经验。此次实训实习完成了《采血与血清分离》、《鸡新城疫（HA）和（HI）试验》、《鸡新城疫紧急预防接种》3个科目的技能考核，优秀率为84%，合格率为16%。

（2）免疫接种过程中存在的问题：①疫苗的接种途径不当，接种技术不规范。养殖户为了省时、省事或者担心在滴鼻、点眼、注射等免疫过程中由于抓鸡会带来应激反应，影响鸡的生长速度和生产性能，因此需经肌肉、皮下和皮内注射的疫苗一律采用饮水免疫，导致抗原的免疫原性降低，埋下今后仍可能发生新城疫的隐患。②免疫接种程序不科学。养殖户依靠经验制定免疫程序，免疫程序多年来一成不变，雏鸡首免时存在母源抗体，首免、二免间隔时间太长，免疫接种后未进行合理规范的免疫监测。

（3）免疫后的管理：疫苗免疫接种后，不能单纯依赖疫苗的作用，应加强饲养管理。免疫接种后 1～2 d饲料和饮水中严禁添加抗病毒药物，鸡舍内外不要消毒。适当提高舍内温度，增加喂料次数，在饮水中加入电解多维或维生素 C、维生素 E 等，促使机体及早产生抗体。此外，还要注意观察鸡群的动态，特别要对鸡群的采食量、饮水量、粪便稀稠以及呼吸情况进行观察并详细记录，并与免疫接种前的数据进行认真对比。若发现异常情况，应及时采取措施[2]。

（4）发生新城疫的处理措施：①全场消毒，对病死鸡焚烧或深埋。②紧急免疫接种。2月龄鸡用Ⅰ系苗肌肉注射；雏鸡用Ⅳ系苗点眼、滴鼻，剂量为常量的2倍，接种顺序为假定健康群→可疑感染群→发病群。③紧急被动免疫接种。注射高免卵黄液及高免血清，使用剂量按厂家说明，对于小规模的个体户推荐使用该法。Ⅰ系疫苗紧急注射不能与高免蛋黄液同时使用，以免相互中和降低效果。因为卵黄液抗体仅维持15 d左右，所以当鸡群病情稳定后应注射油乳剂苗或在注射高免卵黄抗体的同时注射油乳剂苗，刺激免疫系统产生持久免疫力[3]。④注射干扰素增强免疫应答，尤其是激活细胞免疫，但干扰素也不能与疫苗同时使用。综上所述，导致新城疫免疫失败的原因是多方面的，因此对新城疫的防控需从多方面着手，建立有效的管理体制，保证优质的疫苗及正确使用，做好疫苗监测，制定合理的免疫程序，最大限度保证新城疫免疫的有效性，减少免疫失败发生的概率。⑤鸡群接种新城疫疫苗后，经2～3周测定血清中的HI抗体效价。若提高2个滴度以上，说明鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高，说明免疫失败。

参考文献

[1] 黄炎坤，陈理盾，姬向波，等.不同来源的红细胞悬液对鸡新城疫血清抗体检测的影响[J].安徽农业科学，2009，37（29）：14196-14197.

[2] 宫波.鸡新城疫诊断的实验室检验[J].养殖技术顾问，2009（6）：123.

[3] 徐业芬，牛家强，曾群辉.鸡非典型新城疫的防制[J].中国兽医杂志，2007，43（2）：67.

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[34] 潘其辉.苎麻赣苎三号太空诱变SP1代的分离变异[J].中国麻业科学，2008（3）：144-147.

[35] 邢虎成，廖玮玮，揭雨成.我国苎麻育种方法研究进展及面临的问题[J].作物研究，2010（3）：209-214.

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