VEGF—A/VEGFR—2信号通路对胃黏膜癌变过程新生血管的调控作用

[摘要] 目的 研究新生血管在胃病发展不同时期胃黏膜中的生成情况及血管内皮生长因子（VEGF）-A/血管内皮生长因子受体（VEGFR）-2的调控作用。 方法 选择2012年1～12月上海长征医院胃镜室收集非癌变胃黏膜组织（包括慢性胃炎、胃息肉、胃溃疡、肠腺化生）及病理科收集胃癌组织（包括癌组织、癌旁近端、癌旁远端）各20例。采用免疫组化SP法检测微血管密度（MVD）；Western Blot及RT-PCR法检测VEGF-A/VEGFR-2的表达。 结果 新生血管在慢性胃炎、胃息肉、胃溃疡、胃黏膜肠腺化生、胃癌不同区域的表达存在差异，其中，在胃炎胃黏膜中新生血管相对稀疏，而胃息肉、胃溃疡和胃黏膜肠腺化生新生血管稍密集，胃癌新生血管明显密集，有形成血管腔形状。总体上，MVD随着组织恶性转化倾向存在递增趋势，胃炎低于胃息肉、胃溃疡、胃黏膜肠腺化生、癌旁远端，低于癌旁近端，低于胃癌（P < 0.05）。VEGF-A/VEGFR-2对新生血管存在明显的调控作用，其表达和MVD变化高度一致。 结论 微血管生成贯穿在胃黏膜病变不同时期，VEGF-A/VEGFR-2信号通路对新生血管具有调控作用，抑制微血管生成可能具有阻断胃黏膜恶性病变的意义。

[关键词] 胃黏膜癌变；新生血管；血管内皮生长因子-A；血管内皮生长因子受体-2

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（a）-0011-04

大量研究表明，新生血管生成对肿瘤的生长和转移具有重要作用[1]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路是调控新生血管的关键信号通路，其中，血管内皮生长因子（VEGF）-A和血管内皮生长因子受体（VEGFR）-2被认为和肿瘤微血管生成密切相关[2]。研究证实，在结肠癌[3]、乳腺癌[4]、胃癌[5]等肿瘤中均发现微血管密度（microvascular density，MVD）平均值随着TNM分期逐步增高。李学成等[6]、田小林等[7]发现胃癌组织中VEGF-A阳性率明显高于正常组织。但胃癌发生发展过程中可能经历的不同阶段胃黏膜微血管生成情况及与VEGF-A/VEGFR-2的关系少见报道。为此本研究采用免疫组化SP法检测MVD，Western Blot及RT-PCR法检测VEGF-A/VEGFR-2的表达，研究VEGF-A/VEGFR-2信号通路与新生血管变化规律，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

2012年1～12月于上海长征医院胃镜室，取慢性浅表性胃炎、胃息肉、胃溃疡、胃黏膜肠腺化生各20例标本；于病理科取胃癌标本，包括癌组织、癌旁近端、癌旁远端，各20例。癌旁近端组织为取自距胃癌组织边缘3～5 cm胃黏膜组织，癌旁远端组织为取自距胃癌组织边缘5 cm外胃黏膜组织，病理证实均无肿瘤细胞浸润。入选标准：①慢性浅表性胃炎、胃息肉、胃溃疡、胃黏膜肠腺化生符合修订版悉尼系统[8]诊断标准；②胃癌诊断标准参考文献[9]；③排除放化疗病例；④研究方案经伦理委员会批准，患者对受试内容完全了解，并签署知情同意书。

1.2 主要试剂

一抗：CD34 antibody（1∶100，Abcam），Anti-VEGFA antibody、Anti-VEGF Receptor 2 antibody（1∶1000、Abcam）；BCA蛋白定量试剂盒（索莱宝）；逆转录试剂盒（Promega）；鼠兔通用型超敏二抗PV9001、DAB显色液（中杉金桥）；中性树胶、苏木精染液、PMSF裂解液（国药）；PCR反应液（Transistor）；Trizol试剂、引物（Invitrogen公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学SP法

免疫组化SP法常规脱蜡，水化，除去内源性的过氧化氢酶，抗原修复，血清封闭，加1∶100一抗，湿盒中于4°C冰箱中保存过夜，PBS洗5 min×3次，加二抗，湿盒中于37°C温箱中0.5 h，加DAB显色剂，水洗终止显色，苏木精复染，逐级酒精脱水，中性树胶封片，晾干拍照。用已知阳性的组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。每一批实验均设有阳性、阴性对照。

微血管计数参考Weidner等[10]的方法。①CD34阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准；②微血管计数以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数，只要结构不相连，其分支结构也作为1个血管计数；③低倍镜（100×）下观察切片，选择微血管分布最高密度区，然后在高倍镜（200×，每个视野面积为0.785 mm2）下计数3个视野的微血管数，取其平均值为该例的MVD值。

1.3.2 Western Blot相对定量法

1.3.2.1 蛋白的预处理 称取80～120 mg组织，加5倍体积单去污剂裂解液PMSF，匀浆。12 000 r/min离心，取上清液。使用BCA系统进行蛋白初定量。均一化调平上样总蛋白质量至总体积16 μL。每管样本中加入上样缓冲液（含溴酚蓝）。

1.3.2.2 电泳制膜 按目的蛋白大小制取1.0 mm分离、浓缩胶，浸于电泳缓冲液中，注入16 μL预处理蛋白样本。30 min 80V电泳后60 min 120 V电泳，将电泳得到的分离胶按以下顺序叠放：棉花、3层滤纸、分离胶、承载膜、3层滤纸、棉花，4℃转膜。验证转膜成功后用TBST将丽春红洗脱。

1.3.2.3 封闭孵育曝光、抗体洗脱 将承载膜浸于5%脱脂牛奶中，摇晃1.5 h。将膜浸于TBST稀释过的一抗中，4℃孵育过夜，清洗膜10 min×3次。将膜浸于TBST稀释过的二抗中，室温孵育1 h，清洗膜10 min×3次。取膜加ECL发光液，移至曝光袋中。曝光后取片，显影定影冲洗，此时X光片上相应位置的黑色条带即为最终结果。

1.3.2.4 数据分析 Western Blot采用NIH Image J计算灰度值。

1.3.3 RT-PCR相对定量法

1.3.3.1 mRNA的提取 组织加Trizol试剂后匀浆，12 000 r/min离心后弃沉淀，加氯仿混匀，4℃ 12 000 r/min离心取上层水相至另一离心管中，加异丙醇混匀，4℃ 12 000 r/min离心弃上清，RNA沉于管底，加75%乙醇，振荡、沉淀，4℃ 8000 r/min离心弃上清，真空干燥5～10 min。用50 μL DEPC高压处理过的H2O溶解RNA样品，55～60℃ 5～10 min。

1.3.3.2 逆转录 将提取出的mRNA进行逆转录，成为cDNA模板：在微量离心管中加2 μg总RNA，补充DEPC ddH2O达11 μL。加50 μmol/L Oligo（dT）12～18 μL，混匀、离心。70℃加热5 min，将微量离心管插入冰浴1 min。在每管中加RT反应液13 μL（混匀分装），总体积为25 μL，42℃反应60 min。cDNA产物置于-20℃保存。操作以试剂盒说明书为准。

1.3.3.3 PCR实验 以cDNA为模板，进行real time PCR实验。引物溶解：12 000 r/min离心5 min，用ddH2O溶解，配成2 μmol/L的工作浓度。反应液配制：引物常规终浓度设为200 μmol/L，采用20 μL中加1 μL的cDNA模板。扩增条件：95℃ 5 min→95℃ 5 s→60℃ 30 s→溶解曲线分析。

1.3.3.4 引物序列 RT-PCR引物序列见表1。

1.3.3.5 数据分析 在RT-PCR检测实验中，通过CT值进行数据分析，CT值是一个指数而非线性概念，通过PCR信号的对数值和循环数来确定，计算2-ΔCT将统计数据转化成线性形式的数据值。

1.4 统计学方法

使用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，采用Levene检验方差齐性，若总体方差齐，则采用多个样本均数的方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验；若总体方差不齐，则采用Krusakal-Wallis检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 显微镜下微血管形态

本研究采用免疫组织化学SP法检测CD34，显微镜下显示新生血管阳性染色呈棕黄色，表现为分支状、窦隙状、芽孢状、椭圆形及圆形等（图1，见封三）。不同组织类型胃黏膜微血管形态不一：胃炎新生血管相对稀疏，分支状多，有芽胞状，无规则；胃息肉、胃溃疡和胃黏膜肠腺化生新生血管稍密集，芽孢状、椭圆形多，仍无规则；胃癌中新生血管明显密集，多为芽孢状、椭圆形、圆形，有形成血管腔形状。

2.2 不同类型组织的微血管密度

在胃病发展不同时期，各组织类型胃黏膜新生血管的活跃程度，胃癌最高，其次为癌旁近端，癌旁远端、胃息肉、胃黏膜肠腺化生、胃溃疡均高于胃炎，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；而癌旁远端、胃息肉、胃黏膜肠腺化生、胃溃疡两两比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 不同类型组织的VEGF-A/VEGFR-2表达

在胃病发展不同时期，通过Western blot和RT-PCR检测各组织类型胃黏膜中VEGF-A和VEGFR-2蛋白及基因的表达（表3、图2），结果显示，胃癌组织最高，其次为癌旁近端，癌旁远端、胃息肉、胃黏膜肠腺化生、胃溃疡高于胃炎，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；而癌旁远端、胃息肉、胃黏膜肠腺化生、胃溃疡两两比较差异无统计学意义（P > 0.05）。此结果与微血管生成情况一致。

3 讨论

本研究发现，不同组织类型胃黏膜中新生血管的活跃程度、VEGF-A和VEGFR-2的表达，胃癌最高，癌旁近端次之，癌旁远端、胃息肉、胃黏膜肠腺化生、胃溃疡高于胃炎，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；而癌旁远端、胃息肉、胃黏膜肠腺化生、胃溃疡两两比较差异无统计学意义（P > 0.05）。以上结果说明MVD随着组织恶性转化倾向存在递增趋势，VEGF-A/VEGFR-2信号通路对新生血管具有调控作用。

在胃癌发生发展过程中，新生血管为肿瘤生长提供营养物质和氧。目前为止已知的肿瘤促血管因子有10余种， VEGF信号通路是调控新生血管的关键信号通路，其中VEGF-A主要参与肿瘤血管生成的调节，与其相应的受体VEGFR-2结合后，激活下游信号通路，增加血管通透性，刺激内皮细胞增殖，同时诱导内皮细胞迁移，促使血管生成[11]。文献报道，胃癌组织中VEGF/VEGFR2、MVD表达高于癌旁组织[12-13]，与本研究结果一致。提示VEGF-A/VEGFR-2信号通路可诱导胃癌组织新生血管的生成。

胃癌发生过程中可能经历慢性浅表性胃炎、胃溃疡、肠腺化生、胃息肉和癌变等不同阶段，微血管生成贯穿在胃黏膜病变的不同时期。本研究发现，VEGF-A/VEGFR-2信号通路对新生血管具有调控作用，抑制微血管生成可能具有阻断胃黏膜恶性病变的作用，从而预防胃癌发生。

本研究尚存在许多不足之处，如样本量少（每组只有20例）、未进行干预措施等。未来建议扩大样本量，给予相应的干预措施，进一步探讨胃黏膜病变不同时期微血管生成情况及VEGF/VEGFR2的表达。

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（收稿日期：2014-08-10 本文编辑：程 铭）

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