转化生长因子β1在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

[摘要] 目的 通过检测食管鳞癌组织标本及癌旁正常组织标本中转化生长因子β1 （TGF-β1）的水平，探讨TGF-β1与食管鳞癌发生发展之间的关系。 方法 收集2009年9月～2011年10月沈阳医学院奉天医院胸外科39例食管鳞癌组织标本及癌旁正常组织标本，用逆转录聚合酶链反应的方法对标本进行检测，比较食管鳞癌组织及癌旁正常组织TGF-β1信使RNA（TGF-β1 mRNA）的表达水平。 结果 食管鳞癌组织中TGF-β1 mRNA水平（0.76±0.09）显著高于癌旁正常组织（0.23±0.05）；而随着病理分期Ⅰ～Ⅲ期TGF-β1 mRNA水平逐渐增高（Ⅰ期：0.52±0.06；Ⅱ期：0.73±0.03；Ⅲ期：0.92±0.05）。有淋巴结转移组的TGF-β1 mRNA水平（0.91±0.06）显著高于无淋巴结转移组（0.55±0.08）。随着肿瘤细胞局部浸润深度增加，TGF-β1 mRNA水平逐渐增高（T1：0.53±0.03；T2：0.69±0.05；T3：0.93±0.03）。 结论 TGF-β1水平的增高与食管鳞癌的发生发展关系密切。

[关键词] 转化生长因子β1；逆转录聚合酶链反应；食管鳞癌；病理特征

[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0025-03

转化生长因子β（transforming growth factor，TGF-β）是一类多功能的多肽类细胞生长因子，几乎体内的每个细胞都产生TGF-β并存在其受体，参与调节细胞的生长、分化、形态发生及凋亡[1]。目前在人类中，发现有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三个亚型，TGF-β1作为TGF-β超家族的一个重要成员，已被证实在细胞的生长与分化、细胞外基质（ECM）的合成与沉淀、血管的生成及细胞凋亡中起重要作用。在肿瘤的发生发展过程中，TGF-β1能诱导c-sis的表达，但抑制c-myc的表达，TGF-β1具有双相调节作用：在肿瘤早期，抑制肿瘤细胞的生长；在肿瘤的中晚期，它成为肿瘤生长的刺激因子。多年来，TGF-β仍是肿瘤领域研究的热点之一，研究发现TGF-β1作为一类具有多种生物学活性的细胞因子，参与了肿瘤的发生、进展和转移的各个环节并起到重要作用[2]。TGF-β1在食管鳞癌的研究中尚不多见，本研究对TGF-β1在食管鳞癌组织中的表达与食管鳞癌的临床分期、淋巴转移、肿瘤浸润深度的关系进行相关探讨，从而进一步明确TGF-β1在食管鳞癌的发生发展过程具有重要作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2009年9月～2011年10月沈阳医学院奉天医院胸外科食管鳞癌标本共39例，其中包括癌组织上、下5～8 cm的正常组织，手术切除后30 min内置于液氮中保存。所有病例术前均未发现有远处转移，未行放疗、化疗，术后均有病理证实。39例病例中男25例，女14例；≥50岁者26例，<50岁者13例，年龄38～71岁，平均56.4岁；术后病理均为食管鳞癌；TNM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期21例，Ⅲ期12例；其中23例有淋巴结转移。分期标准依照食管鳞癌AJCC指南中的食管鳞癌TNM分期标准划分。组织分化程度：高分化9例，中分化13例，低分化17例。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 食管鳞癌组织与癌旁正常组织分别取100 mg，加入1 mL Trizol，组织匀浆器将组织匀浆，室温保持5 min使组织充分裂解，加入0.2 mL氯仿充分振荡15 s，室温保持3 min，12 000 r/min，4℃离心15 min，轻取最上层无色水相，加入0.5 mL异丙醇室温保持10 min，12 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清，加入75%乙醇1 mL，12 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清，室温干燥5～10 min，将沉淀溶于适量DEPC水中，测OD260/OD280及RNA浓度，分装，-80℃冰箱中保存。

1.2.2 反转录及PCR扩增 反转录体系如下： 5×PrimeScript Buffer 2 共4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，总mRNA 10 μL，加RNase Free d H2O至 20 μL。反转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃，反转录产物于-20℃保存。试剂：Rnase Free dH2O17.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 1.5 μL，TGF-β1上游引物0.5 μL，TGF-β1下游引物0.5 μL，Taq E 0.5 μL反转录PCR产物2 μL，总体积25 μL。PCR反应条件为：95℃变性2 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 90 s，循环30个周期，最后于72℃延伸10 min。TGF-β1上游引物： 5"-GCCCTGGACACCAACTATGCT-3"；TGF-β1下游引物： 5"-AGGCTCCAAATGTAGGGGCAGG-3"，扩增片段长度为161 bp；内参β-actin上游引物： 5"-GTGGGCCGGTGTAGGCACCA-3"；下游引物： 5"-GGTTGGCCTAGGGTTCAGG-3"，扩增片段长度为246 bp。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 取10 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶经UVP凝胶成像分析系统进行扫描分析。TGF-β1 mRNA相对表达水平计算公式如下：某样品TGF-β1 mRNA相对表达水平=样品TGF-β1扫描值/样品β-actin扫描值。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌组织及癌旁正常组织TGF-β1 mRNA的表达水平

在39例食管鳞癌标本中，各期食管鳞癌组织中TGF-β1 mRNA水平均显著高于癌旁正常组织（P < 0.01）。见表1。

2.2 不同分期食管鳞癌组织中TGβ-β1 mRNA的表达水平

随着病理分期Ⅰ～Ⅲ期的增加，TGF-β1 mRNA表达水平逐渐增高（P < 0.05），见表2。

2.3 不同病理特征的食管鳞癌患者TGF-β1 mRNA的表达水平比较

不同年龄及不同组织分化程度的食管鳞癌组织中的TGF-β1 mRNA水平无显著差异（P > 0.05）。有淋巴结转移组的TGF-β1 mRNA水平显著高于无淋巴结转移组（P < 0.01）。在肿瘤细胞局部浸润深度中，T2组食管鳞癌组织中的TGF-β1 mRNA水平显著高于T1组（P < 0.01），同时T3组食管鳞癌组织中的TGF-β1 mRNA水平显著高于T2组（P < 0.01）。在国际抗癌联盟中的食管鳞癌标准划分中T1代表肿瘤浸润固有层或黏膜下层；T2代表肿瘤浸润肌层；T3代表肿瘤浸润外膜。见表2。

3 讨论

TGF-β是由两个结构相同或相近的、分子量为12 500的亚单位借二硫键连接的双体。每个亚基由112个氨基酸组成，这112氨基酸残基是由含400氨基酸残基的前体份子（per-pro-TGF-β）从羧基端裂解而来。TGF-β在人体内存在三种亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1是人体内的主要存在形式。TGF-β的受体亦有3种亚型：TβRⅠ、TβRⅡ、 TβRⅢ。TGF-β通过磷酸化Smads启动细胞信号传导，发挥重要作用[3]。TGF-β受体-细胞内信号因子-基因表达-细胞生长抑制、分化或调亡，这一通路中的任何一个环节异常都将导致细胞异常增殖[4-5]。

一些研究显示，TGF-β与肿瘤发生发展有着密切的关系，并且对肿瘤细胞的生长具有抑制和促进双重生物学效应[6]。首先，TGF-β对早期肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。TGF-β信号的肿瘤抑制作用源自其诱导多个基因表达的能力，这些基因参与抑制细胞增殖、诱导凋亡、激活自噬、通过基质成纤维细胞抑制生长因子的信号、抑制炎症，以及抑制血管生成。这些作用维持了正常组织内的动态平衡，防止肿瘤形成的早期阶段：①TGF-β可在转录及转录后水平抑制原癌基因c-myc的表达，使细胞生长停滞于G1期或延长G1期[7-9]；②TGF-β通过抑癌基因p53通路对肿瘤的早期形成具有明显的阻抑作用[10]；③TGF-β对周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDK）及周期蛋白发挥抑制作用。CDK和周期蛋白是完成细胞生长周期所必需的[11]。综上所述，TGF-β可能是肿瘤早期发生的一个重要的保护性标志物[12-13]。但是本实验中所得到的食管鳞癌组织标本多来源于中晚期肿瘤，故上述情况本实验中并未涉及。

同时，由于TGF-β对肿瘤发生发展的作用很复杂，因此一些研究也揭示了TGF-β对一些恶性肿瘤的发展起到促进作用。Massague等[11]研究显示TGF-β能抑制T和B淋巴细胞增殖分化，抑制NK细胞和单核细胞的杀伤活性，抑制免疫球蛋白合成，拮抗IL-2、TNF等免疫调节因子的作用，使肿瘤细胞逃避机体“免疫监视”；TGF-β还可以增加瘤细胞与细胞外基质相互作用，促进肿瘤细胞的浸润；诱导表达VEGF，对促进肿瘤血管生成方面有重要作用，从而促进肿瘤细胞的转移。研究证实在乳腺癌中，高水平的TGF-β1可以促进其浸润与转移[14]。本研究结果显示，各期食管鳞癌的TGF-β1 mRNA水平显著高于癌旁正常组织；也有文献报道，TGF-β在前列腺癌[15]，大肠癌[16]，乳腺癌[14]等恶性肿瘤中过度表达；并且本研究中还发现，随着肿瘤浸润深度的增加，TGF-β1 mRNA水平也随着增高；同时，有淋巴结转移的食管鳞癌组织中TGF-β1 mRNA水平也显著高于无淋巴结转移的食管鳞癌组织；而不同年龄及不同分化程度的食管鳞癌组织中的TGF-β1 mRNA水平无显著差异。这一结果显示，在食管鳞癌组织中，肿瘤细胞的浸润与转移和TGF-β1 mRNA有关。TGF-β1与肿瘤的侵袭转移相关性在大肠癌已经得到证实[17]。综合国内外研究与本实验结果，食管鳞癌的发生发展与TGF-β1的表达有关，即TGF-β的增高是促使食管鳞癌发生的一个重要因素[18]；同时TGF-β与食管鳞癌的浸润和转移也密切相关。

目前国内外对TGF-β已有相关研究，但是涉及TGF-β1在食管鳞癌组织中的表达与病理分级、临床分期、肿瘤浸润深度、淋巴转移的关系的研究相对较少[19]。本研究分别针对不同病理分级、临床分期、肿瘤浸润深度、淋巴转移的食管鳞癌标本TGF-β1 mRNA水平进行检测，得出结论：TGF-β1在食管鳞癌的发生、进展与转移过程中有发挥重要的作用。但是，TGF-β1在肿瘤发展过程中的作用及机制尚没有完全明确，对于不同类型的肿瘤甚至不同的瘤细胞株而言，TGF-β1可能发挥不同甚至相反的生物学效应，有待进一步研究。而随着肿瘤免疫学和生物基因工程的发展，随着人们对转TGF-β1不断认识，这将为人们有效防治肿瘤提供一条新的途径。

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（收稿日期：2013-03-26 本文编辑：卫 轲）

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