抗虫耐除草剂玉米杂交种瑞丰1号—双抗12—5对3种主要鳞翅目害虫的抗性

摘要：本試验用田间接虫和室内生测方法，研究国产转基因玉米杂交种瑞丰1号-双抗12-5（RF1-12-5）对3种主要的玉米鳞翅目害虫亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫的抗性。田间结果表明：RF1-12-5对亚洲玉米螟、棉铃虫的抗性在相应的鉴定时期均达到高抗水平，RF1-12-5心叶期对黏虫的抗性为抗性水平。室内鉴定结果表明：心叶期，RF1-12-5对亚洲玉米螟抗性起效较慢，饲喂48～72 h后校正死亡率分别为63.97%、77.14%、88.00%；吐丝期饲喂48 h后校正死亡率达100%，抗性显著；籽粒期饲喂24、48、72 h后校正死亡率分别为68.86%、83.96%、98.03%。心叶期饲喂24 h后对黏虫基本无抗性效果，但48、72 h后的校正死亡率分别达到94.64%、100%。吐丝期饲喂24 h后对棉铃虫抗性达到87.59%，48 h后对棉铃虫校正死亡率达到100%，抗性较强。总体来看，RF1-12-5田间对亚洲玉米螟、棉铃虫抗性较高，对黏虫抗性略低；室内心叶期对亚洲玉米螟抗性较弱，但在其他时期对亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫均表现了较好的抗性。因此RF-12-5具有推广应用的潜力。

关键词：抗虫耐除草剂玉米；瑞丰1号-双抗12-5；鳞翅目害虫；田间抗虫性；室内抗虫性

中图分类号：S513.037文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0109-06

Abstract Through filed experiments and indoor bioassay， the resistances of domestic transgenic maize hybride Ruifeng 1-Double Resistance 12-5（RF1-12-5） against three major maize lepidopteran pests， Pyrausta nubilalis， Mythimna separate and Helicoverpa armigera were studied. The results of the filed experiments showed that the resistance of RF1-12-5 against Ostrinia furnacalis and Helicoverpa armigera were in high level during the corresponding identification periods. The resistance against Mythimna separate was in moderate level during the whorl stage. The indoor bioassay results showed that RF1-12-5 had slower resistance against Ostrinia furnacalis at whorl stage. After feeding with RF1-12-5 leaves for 24，48 and 72 hours， the corrected mortality rates were respectively 63.97%， 77.14% and 88.00%. At filamentous stage， the resistance was significant and the corrected mortality rate reached 100% after 48 hours. During the grain period， the corrected mortality rates were respectively 68.86%， 83.96% and 98.03% after 24，48 and 72 hours. For Mythimna separate， at whorl stage， there was no obvious resistant effect after 24 hours， but the corrected mortality rates were 94.64% and 100% respectively after 48 and 72 hours. For Helicoverpa armigera， RF1-12-5 showed obvious resistance at filamentous stage and the corrected mortality rates were 87.59% and 100% after 24 and 48 hours respectively. In all，RF1-12-5 showed obvious field resistance against Ostrinia furnacalis and Helicoverpa armigera，but lower resistance against Mythimna separate. It showed lower resistance against Ostrinia furnacalis at whorl stage during indoor bioassay， but better resistance against Ostrinia furnacalis， Mythimna separate and Helicoverpa armigera at other stages. We concluded that RF1-12-5 had the potential for popularization and application in the future.

Keywords Insect-and herbicide-resistant maize； Ruifeng 1-Double Resistance 12-5； Lepidopteran pests； Field insect resistance； Indoor insect resistance

玉米是我国重要的粮食作物和加工原料，在我国粮食生产中占据重要位置。亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫是影响玉米产量的三大主要鳞翅目害虫，在个别年份，害虫的为害甚至会造成玉米绝收[1，2]。长期以来，农业生产中均采用化学方法对鳞翅目害虫进行防治。但化学防治对环境危害大，同时存在防治不及时的缺点。随着生物技术的发展，转基因玉米转化体系早已成熟，国外研发的转基因抗虫、耐除草剂、品质改良玉米自1996年起相继在美国、巴西、阿根廷等国家进行推广应用，取得较好的防治效果，大大减少农药的使用，减轻环境污染，降低劳动力成本。近20年来，转基因作物种植面积不断扩大[3]。我国自2008年启动转基因重大专项，目前已有众多的转基因玉米进入不同阶段试验，转植酸酶玉米于2009年底取得生物安全证书[4]。而对转基因抗虫及耐除草剂玉米的研究最多，也最成熟[5-7]。从技术储备、生产地位等各方面综合分析，转基因玉米是最有可能首先在我国推广应用的粮食作物，具有广阔的应用前景[8-10]。双抗12-5是浙江大学研发的含有抗虫基因cry1Ab/cry2Aj与耐除草剂基因G10evo的转基因玉米新品系[11]， cry1Ab/cry2Aj对亚洲玉米螟有较高的杀虫活性，草甘膦靶标酶基因G10evo对草甘膦具有很高的耐受性[12-16]。本试验旨在研究双抗12-5衍生品种瑞丰1号-双抗12-5对玉米重要鳞翅目害虫的抗性，以期为该品种在生产上推广提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试玉米品种：瑞丰1号-双抗12-5（简称RF1-12-5，转基因玉米）、瑞丰1号（简称RF1，为RF1-12-5的杂交亲本）、综31（感虫对照品种）、登海3号（简称DH3，当地品种）。RF1-12-5、RF1由浙江大学提供，综31由中国农业科学院提供，DH3购自当地种子市场。

供试昆虫：亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫，均由本研究室人工繁殖。

1.2 试验设计

试验于2016年在农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（济南）环境安全试验基地进行。所有玉米品种全生育期不喷施杀虫剂，常规方式播种及管理。随机区组设计，每品种3次重复。小区面积为30 m2（5 m×6 m），行株距60 cm×25 cm，小区间设2 m间隔，以防害虫在不同小区之间扩散。

1.3 田间抗虫性鉴定

亚洲玉米螟田间抗虫鉴定：玉米心叶期（6～8叶期）和吐丝期分别间隔3 d人工傍晚接种初孵幼虫2次。心叶期接种到心叶内，吐丝期接种到花丝上。每小区人工接虫40株，每株接虫30～40头，最后一次接虫14 d后调查。

心叶期调查：调查接虫株中上部叶片亚洲玉米螟为害程度，包括受害叶片上的虫孔大小、数量及分布等，计算食叶级别及食叶级别平均值，根据食叶级别平均值判定玉米心叶期对玉米螟的抗性水平。为害程度分级标准及抗性评价标准参照NY/T 1248.5—2006[17]的规定。

吐丝期调查：根据雌穗被害情况、蛀孔数量、隧道长度（cm）及存活幼虫龄期数量等，计算各小区穗期雌穗被害级别平均值。按照雌穗被害级别平均值判定玉米穗期对亚洲玉米螟的抗性水平。雌穗被害级别分级标准及抗性评价标准参照农业部953号公告—10.1—2007[18]的规定。

黏虫田间抗虫鉴定：玉米4～6叶期接虫，接虫方法及接虫次数同亚洲玉米螟。最后一次接虫14 d后调查玉米叶片受黏虫为害程度及幼虫存活数，记录心叶被害级别并计算心叶期食叶级别平均值，判定玉米心叶期对黏虫的抗性水平。为害程度分级标准及抗性评价标准参照农业部953号公告—10.1—2007[18]的规定。

棉铃虫田间抗虫鉴定：玉米吐丝期接虫，接虫方法及接虫次数同亚洲玉米螟。最后一次接虫14 d后调查雌穗被害率、幼虫存活数、雌穗被害长度，确定雌穗被害级别并计算雌穗被害级别平均值，判定玉米对棉铃虫的抗性水平。雌穗被害级别分级标准及抗性评价标准参照农业部953号公告—10.1—2007[18]的规定。

1.4 室内抗虫性鉴定

亚洲玉米螟： 于玉米心叶期、吐丝期、籽粒期分别采集相应幼嫩组织饲喂2日龄幼虫，每玉米生育期重复6次，每重复10头幼虫。饲喂 24、48、72 h后调查幼虫死亡率。

黏虫：玉米心叶期采集相应幼嫩心叶饲喂2日龄幼虫，重复6次，每重复10头幼虫，饲喂24、48、72 h后调查幼虫死亡率。

棉铃虫：玉米吐丝期采集幼嫩花丝饲喂2日龄幼虫，重复6次，每重复10头幼虫，饲喂24、48、72 h后调查幼蟲死亡率。

饲喂时，每天更换相应的新鲜幼嫩组织。室内抗虫性鉴定时，对照组幼虫死亡率>20%放弃试验结果，对照组幼虫死亡率<20%计算校正死亡率。本试验中，对照组幼虫死亡率为非转基因玉米RF1和DH3幼虫死亡率平均值。

校正死亡率（%）=（处理组幼虫死亡率-对照组幼虫平均死亡率）/（1-对照组幼虫平均死亡率）×100。

2 结果与分析

2.1 田间抗性鉴定结果

2.1.1 亚洲玉米螟田间抗性鉴定 玉米心叶期接虫后1周左右，非转基因玉米叶片出现数量较多的1～2 mm左右虫孔，转基因抗虫玉米虫孔数量很少，14 d后的调查结果如表1所示，心叶期RF1-12-5食叶级别平均值为1.87，DH3、 RF1、综31分别为5.21、7.44、8.56。按玉米对玉米螟的评价标准，心叶期RF1-12-5对亚洲玉米螟的田间抗性达到高抗水平， RF1、综31达到感虫水平， DH3达到中抗水平。

吐丝期，RF1-12-5接虫株雌穗及花丝基本未受害，仅少量花丝枯死，雌穗被害级别平均值为1.07，而DH3、 RF1、综31的花丝及雌穗受害严重，部分有活虫，花丝枯死，穗尖大部分籽粒被啃食，三者雌穗被害级别平均值分别为5.77、7.13、5.67。按玉米雌穗对亚洲玉米螟的评价标准判断，吐丝期DH3、 RF1、综31对亚洲玉米螟均为感虫水平，而RF1-12-5达到高抗水平（表1）。

2.1.2 黏虫田间抗性鉴定结果 接种黏虫后，4个品种玉米均有黏虫为害症状。 RF1、综31为害重，DH3略轻，表现为虫孔多，单个虫孔较大，甚至有缺刻。RF1-12-5黏虫为害症状轻，表现为单个虫孔较小，虫孔数量较少。RF1、综31食叶级别平均值分别为6.31、6.64，均达到感虫水平， DH3平均值略低，为5.88，达到中抗水平，RF1-12-5则为2.67，到达抗性水平（表2）。

2.1.3 棉铃虫田间抗性鉴定结果 接种棉铃虫后，DH3、RF1、综31棉铃虫为害症状明显，表现为花丝完全受害，秃穗，穗尖被棉铃虫啃食，有活虫；而RF1-12-5花丝基本未受害，雌穗完整，未受害。DH3、RF1、综31雌穗被害级别平均值均大于5.1，對棉铃虫抗性均表现为感虫水平，雌穗被害率93.33%～100%，5级以上为害较多，平均每株活虫数为0.5头以上； RF1-12-5雌穗被害级别平均值仅为0.30，对棉铃虫的抗性达到高抗水平，雌穗被害率虽然为20.00%，但均为1级、2级为害，未发现活虫存在（表3）。

2.2 室内抗虫性鉴定结果

2.2.1 亚洲玉米螟室内抗虫性鉴定 由表4可知，玉米心叶期叶片饲喂亚洲玉米螟24 h后，DH3、RF1幼虫死亡率在10%以内， RF1-12-5的幼虫死亡率为66.67%，校正死亡率为63.97%。48 h后，DH3、RF1幼虫死亡率大于10%， RF1-12-5则为80.00%，校正死亡率为77.14%；72 h后，DH3、RF1幼虫死亡率接近20%， RF1-12-5达90.00%，校正死亡率为88.00%。

吐丝期DH3、RF1饲喂亚州玉米螟24 h后死亡率在5%左右， RF1-12-5为93.33%，校正死亡率为93.02%；48 h后DH3、RF1饲喂玉米螟死亡率在10%以内， RF1-12-5饲喂玉米螟死亡率为100%；72 h后DH3RF1饲喂亚洲玉米螟死亡率在15%左右，RF1-12-5达100%。（表4）。

籽粒期饲喂亚州玉米螟24 h后，DH3、RF1幼虫死亡率在10%以内， RF1-12-5则为71.33%，校正死亡率为68.86%；48 h后DH3、RF1幼虫死亡率10%左右，RF1-12-5为85.67%，校正死亡率为83.96%；72 h后DH3、RF1幼虫死亡率接近20%，RF1-12-5为98.37%，校正死亡率为98.03%（表4）。

总体来看， 室内RF1-12-5吐丝期对亚洲玉米螟抗性高于心叶期和籽粒期。

2.2.2 黏虫室内抗虫性鉴定 饲喂24 h后，RF1-12-5对黏虫有一定抗虫效果，校正死亡率为8.47%； 48 h后，DH3、RF1黏虫幼虫死亡率在10%以内，RF1-12-5则为95.00%，校正死亡率为94.64%，表现较强的抗性效果； 72 h后，DH3、RF1黏虫幼虫死亡率分别为6.67%、13.33%， RF1-12-5为100%（表5）。总体来看，RF1-12-5对黏虫室内抗性起效较慢，饲喂48 h后才有明显的抗性，但后续抗性效果较好，饲喂48～72 h后可明确判断抗性效果。

2.2.3 棉铃虫室内抗虫性鉴定 饲喂24 h后， DH3、RF1幼虫死亡率低于10%，RF1-12-5则为88.33%，校正死亡率为87.59%；48 h后，DH3、RF1幼虫死亡率均增加至10%左右，RF1-12-5则为100%（表6）。RF1-12-5室内对棉铃虫同样表现出明显的抗性。饲喂24～48 h后可明确判断抗虫效果高低。

3 讨论与结论

转基因作物目标性状是否如期高效表达，并在实践中对靶标生物起到切实作用，是决定一种转基因作物能否进行后期推广、应用的关键。RF1-12-5中的抗虫基因cry1Ab/cry2Aj表达的Bt蛋白理论上对鳞翅目害虫具有较高的杀虫活性，本研究采用田间人工接虫及室内组织饲喂两种方式就RF1-12-5对3种主要玉米鳞翅目害虫亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫的抗性进行研究，明确其对3种害虫的抗性效果。

亚洲玉米螟6月上、中旬为第1代卵盛期，第1代幼虫群居于玉米心叶喇叭口处或嫩叶上取食叶片表皮及叶肉后潜入心叶内蛀食心叶，使被害叶呈半透明薄膜状或成排的小圆孔。 8月上、中旬第3代卵盛期，第3代幼虫发生在夏玉米穗期，在玉米打苞后钻入苞内，抽雄后即向下转移，蛀入茎内为害。因此，两次发生盛期即夏玉米6～8叶期、花丝期是控制亚洲玉米螟为害的关键时期。本研究田间鉴定结果表明，瑞丰1号-双抗12-5在这两个时期对玉米螟抗性表现明显，虫孔极少且孔径小，食叶级别平均值分别为1.87、1.07，远低于瑞丰一号和登海3号，对亚洲玉米螟均表现为高抗水平，抗虫效果显著，这与常雪等的研究结果一致[19]。本研究对亚洲玉米螟室内抗虫鉴定表明，心叶期饲喂72 h后校正死亡率为88.00%；籽粒期饲喂72 h后校正死亡率达到98.03%，吐丝期饲喂48 h后校正死亡率即可达100%，吐丝期对亚洲玉米螟抗性高于心叶期和籽粒期。常雪的室内鉴定结果[19]同样表明，双抗12-5在心叶期对亚洲玉米螟抗性较吐丝期和雌穗期低，这与常雪发现Bt蛋白表达量在吐丝期高于心叶期的研究结果相符。王江等[20]对双抗12-5的研究表明，双抗12-5对玉米螟田间达高抗水平，室内生测表明心叶期、吐丝期接虫后第5 d幼虫死亡率达90%，最终效果与本研究基本一致，抗性发挥时间差异可能是虫源不同或者饲养条件差异所致。与国外广泛推广品种Bt11相比，RF1-12-5对玉米螟的抗性并不逊色[21]。

黏虫是我国著名的迁飞性、暴食性及杂食性害虫，本身具有较强的环境适应能力。黏虫在山东1年发生3代，第2代危害夏玉米。1、2龄幼虫啃食叶肉成天窗，3龄以后沿叶缘蚕食成缺刻，危害严重时吃光大部叶片，只残留很短的中脉。常雪等[22]对国外转cryIAb基因玉米Yield Gard的黏虫抗性研究发现，接种黏虫10 d后黏虫死亡率接近100%。本研究田间鉴定结果表明，瑞丰1号-双抗12-5对黏虫抗性较玉米螟低，接虫196 h食叶级别平均值为2.67，达到抗性水平，而室内鉴定虽然抗性起效较慢，但随着饲喂时间延长，同样表现出较好的抗性效果。由于黏虫幼虫为多食性害虫，具有迁移危害的习性，因此，各龄期幼虫均有可能发生，抗虫玉米不同生育期、不同器官Bt蛋白表达量均有差异[19]，因此有必要采用不同生育期的相应组织器官对各龄期黏虫幼虫进行抗性鉴定，以便更全面地研究抗虫玉米对黏虫的抗性。

棉铃虫一般第4代为害夏玉米。夏玉米棉铃虫卵80%左右落在夏玉米抽出但未散粉的雄穗上，卵孵化后幼虫集中在雌穗顶端花丝上取食。从吐丝期鉴定结果看，瑞丰1号-双抗12-5 田间及室内对棉铃虫均有很好的抗性效果，田间雌穗被害率低，为20.00%，且多为低级别为害，未调查到活虫，抗性达高抗水平；室内鉴定校正死亡率48 h后达100%。常雪等[22]对国外品种Yield Gard的田间鉴定结果表明，雌穗被害率为3.5%，危害级别为0.007，百株存活幼虫14.3头。尽管二者之间存在一定差异，但差异是由接虫数量及调查方法不同所致。本试验中，瑞丰1号-双抗12-5田间接虫并未调查到活虫存在，表明瑞丰1号-双抗12-5可以很好地控制棉铃虫为害，且抗虫效果完全达到国外品种水平。

田间抗性鉴定受田间自然条件的影响，接虫后幼虫存活率较低，但存活下来的幼虫生活力强，在非转基因植株及感虫品种上很容易造成可见的、明显的为害症状，能够直接反映出植物的田间抗性表现。室内抗性鉴定由于饲养条件变化较大，不同昆虫对环境适应性差别较大，有时对照死亡率较高，影响抗性的判断。但由于Bt蛋白发挥作用较快，一般接虫后24～48 h可看到明显的效果。本研究表明，国产转基因玉米瑞丰1号-双抗12-5对亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫具有理想的抗性效果。

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