宜昌橙体细胞染色体的45SrDNA荧光原位杂交分析

摘要: 【目的】 为了初步探讨宜昌橙（Citrus ichangensis Swingle）体细胞染色体联会发生的机制，【方法】以中国农业科学院国家种质重庆柑橘圃（CRICAAS）提供的宜昌橙为试验材料，利用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization， FISH）研究了其体细胞有丝分裂中期染色体上45S rDNA的分布情况，并结合联会区域比较分析。【结果】结果表明，不同类型宜昌橙细胞分裂中期染色体45SrDNA的分布位点无明显差异，均存在4个杂交位点，分别位于第2对同源染色体的短臂端部或者近端部，及第9对染色体的次缢痕区域。【结论】宜昌橙体细胞染色体联会现象并非随机生物现象，而是宜昌橙固有的细胞学特征；其体细胞染色体联会以同源染色体联会为主，推测可能与异染色质集中区域或者结构形成有关。

关键词: 宜昌橙； 体细胞； 染色体联会； 荧光原位杂交； 异染色质

中图分类号：Ｓ６６6．4 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－985－０5

宜昌橙为（Citrus ichangensis）为芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）常绿果树，具抗寒性强、耐贫瘠、矮化，且具有适应性广和抗病性强（尤其是柑橘溃疡病）特点，是非常宝贵的柑橘种质资源和砧木材料，目前对宜昌橙的研究集中在起源、地理分布、砧木利用以及生理特性方面，而对其细胞学研究则相对较少。

染色体在细胞分裂期配对（chromosome pairing），或者称联会（synapsis）往往是生物体形成配子的减数分裂特有现象，是减数分裂的重要特征。Overton[1]和Metz[2]分别于1909和1916年报道了体细胞染色体联会现象。根据体细胞有丝分裂中期和间期染色体距离的测量结果分析，有学者认为某些动物和植物体细胞中同源染色体位置常常是非随机的相互靠近，并称此现象为体细胞同源染色体配对（somatic pairing），也称为体细胞联合或者联会（somatic association or synapsis）[3]。该领域以往的研究多数是停留在染色体相互靠近这一表面现象的描述和统计，关于染色质或者染色体丝的真正连接和可能发生的基因重组和遗传物质的交换以及联会的机制方面的研究也只是在少数物种中有所涉及。

前期研究发现宜昌橙是体细胞染色体联会很好的材料，不仅可清晰的观察到染色体质或丝之间的连接，且经过初步统计，联会频率达27.1%～40.2%，这为进一步深入研究其联会发生的染色体区域、染色体类型和联会机制创造了重要前提条件。我们从细胞学角度，利用45S rDNA荧光原位杂交技术（（fluorescence in situ hybridization， FISH）对宜昌橙体细胞有丝分裂中期的染色体进行观察和研究，分析了45S rDNA在染色体上的分布位点数目和分布区域，初步探讨了宜昌橙体细胞染色体联会发生的机制，为后续进一步的研究提供借鉴和参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.2 45S rDNA-FISH分析 45S rDNA序列质粒由南开大学惠赠，质粒DNA提取采用北京鼎国的质粒快速提取试剂盒，检测DNA质量用0.8%琼脂糖凝胶电泳；探针（Roche公司）标记使用地高辛随机引物延伸法；原位杂交及杂交信号的检测参照Chen等[5]、Jiang等[6]及Kamstra等[7]的方法，稍作改动。主要包括染色体标本前处理，探针标记，封阻DNA制备，杂交缓冲液配制及杂交，洗脱及信号检测，镜检图像采集。其中染色体制片衬染试剂为DAPI，所激发的荧光为蓝色，抗体结合时均采用Anti-digoxingenin-fluorescein，所激发的荧光为绿色，为了便于图片分析，将衬染颜色模拟转换为红色，因此合成后在信号的区域则显示为黄绿色。

2 结果与分析

3 讨 论

3.1 45SrDNA与宜昌橙体细胞染色体联会

通过分析45SrDNA在染色体分布的数目和定位的位置，可以很好地用于鉴别染色体，同时在系统发育学和物种亲缘关系研究中也是一项很重要的依据。45SrDNA是高度串接重复序列，在基因组上有一对或者几对染色体具有此位点，在染色体上的物理位置具有一定的固定性，可以为研究基因组在分子和染色体水平上的进化提供线索[10]，可以有效地反映种、属间的分化程度[11]。通过FISH技术将45SrDNA在染色体上进行定位，可以为核型分析提供有效的细胞学标记，特别对于染色体较小且形态相近的物种[12]，并且对研究基因组间的关系、进化情况以及在基因组内区分染色体类型也具有重要意义[13]。

本文结合荧光原位杂交技术研究了宜昌橙体细胞中期染色体上45SrDNA在宜昌橙体细胞染色体上的分布区域和染色体的联会进行了比较分析，发现它的分布位点主要是第2对同源染色体的短臂端部或者近端部，及第9对染色体的次缢痕区域。它的分布位点呈现一定的物理位置的固定性。梁国鲁等[9]曾对国家果树种质柑橘圃的60个具有代表性的柑橘属采用Tanaka的分类系统进行分类发现，宜昌橙的随体组来自枸橼的1对缢痕大随体和柚的1个大随体。这与梁国鲁等[9]的研究结果呈现出一致性。

3.2 宜昌橙体细胞染色体联会可能的机制

体细胞染色体联会现象发生的机制，国内外学者的研究报道中尚未形成定论。有学者认为是化学药剂对有丝分裂中期染色体的排列有影响，如秋水仙素，8-羟基喹啉、溴代萘、放线菌酮能增加某些染色体间的距离，而氯霉素则有促进体细胞染色体联会的作用。Avivi等[14]发现秋水仙碱对普通小麦具端着丝粒同源染色体联会现象具抑制作用，在预处理时间相同情况下，着丝粒间的平均距离随处理液浓度的增加而增加。他们认为秋水仙碱破坏了纺锤丝微管蛋白的形成，而抑制同源染色体联会。Singh等[15]在证明了小麦——黑麦体细胞染色体联会现象的同时，也认为化学药物对染色体的预处理并不影响同源染色体的配对。还有学者认为同源染色体的联会现象是一种环境效应，并非生物体固有特性。Ravindran[16]用不同的培养基培养虎眼万年青（Ornithogalun virens），发现根尖细胞同源染色体的联会是些土壤因子后效应，pH值则可能使核蛋白的离子发生变化，导致某些染色体紧密连接。但戴灼华等[17]持相反意见，他发现不同地区金色果蝇近缘种品系脑神经节细胞的同源染色体有规律地联会，并认为是果蝇物种的固有特性，而非人为或者化学药物的作用。

也有学者认为是异染色质区段相互吸引并黏合的结果。Ashley[18]对O. virens 花粉生殖核及根细胞染色体的研究发现，经C带技术处理后，未显带的非同源染色体端粒间仍发生联会。有研究表明，染色体联会与间期染色中心有关，而染色中心与中期染色体的结构异染色质一致[19]。所以染色体结构异染色质也可能是促使体细胞染色体联会的一种因素。Avivi等[14]在普通小麦中发现了影响体细胞同源染色体联会的基因，而在植物减数分裂中也发现了一些控制同源染色体联会的基因。这就说明不论在有丝分裂还是减数分裂过程中确实存在基因的调节作用，同时也解释了为什么体细胞染色体的联会现象只在部分物种中发现，而非广泛的现象。

从本实验的结果显示出宜昌橙体细胞染色体联会是非随机的染色体行为，是相对稳定而且是以某种特异同源染色体为主，第2对同源染色体的短臂端部或者近端部，及第9对染色体的次缢痕区域上。通过以上综合分析，提出宜昌橙体细胞染色体联会现象并非随机生物现象，而是宜昌橙固有的细胞学特征；其体细胞染色体联会以同源染色体联会为主，推测可能与异染色质集中区域或者结构形成有关。后续的进一步开展对宜昌橙体细胞染色体高级结构和特殊区域以及异染色质功能的研究具有重要的理论意义和应用价值。

参考文献 References:

[1]Overton. On the organization of the nuclei in the pollen mothercells of certain plants，with especial reference to the permanence of the chromosomes[J]. Annals of Botany，1909，23（1）:19-62.

[2]METZ C W. Chromosome studies on the Diptera: Ⅱ. The paired association of chromosomes in the Diptera and its significance[J]. J Exp Zool， 1916，21: 213-279.

[3]XIONG Zhi-ting. The karyotype of Silphium Perfoliatum Linn and its homologous chromosome random arrangement at mistosis metaphase[J]. Hereditas，1989，11（4）: 5-8.

熊治廷.松香草核型及有丝分裂中期同源染色体随机排列[J]. 遗传，1989，11（4）: 5-8.

[4]CHEN Rui-yang， SONG Wen-qin， LI Xiu-lan. A new method of making sample of plant mitotic chromosome[J]. Acta Botanica Sinica，1979，21（3）: 297-298.

陈瑞阳，宋文芹，李秀兰. 植物有丝分裂染色体制片的新方法[J]. 植物学报， 1979，21（3）: 297-298.

[5]CHEN Q F， ARMSTRONG K. Genomic in situ hybridization in Avena Saliva[J]. Genome，1994， 37: 607-612.

[6]JIANG J M， GILL B S. Sequential chromosome banding and in situ hybridization analysis[J]. Genome， 1993，36: 792-795.

[7]KAMSTRA S A， KUIPERS A G J， DE JEN M J ET Al. The extent and position of homoeologous recombination in a distant hybrid of Alstroemeria: a molecular cytogenetic assessment of first generation backcross progenies[J]. Chromosome，1999， 108: 52-63.

[8]CHEN Rui-yang， AN Zhu-ping， Kenji Taniguchi. Chromosome atlas of Chinese principal economic plants Tomus ⅠChromosome atlas of Chinese fruit trees and their close wild relatives[M]. Beijing:International Academic Publishers，1993: 440-443.

陈瑞阳，安祝平，谷口研至. 中国主要经济植物染色体图谱第一册中国果树及其野生近缘植物染色体图谱[M]. 北京: 万国学术出版社，1993: 440-443.

[9]LIANG Guo-lu，CHEN Quan-you. Studies on the system and evolution of satellite chromosoms in Citrus[J]. Journal of Southwest Agricultural University，1994，16（2）: 106-110.

梁国鲁，陈全友. 柑桔属随体染色体系统演化研究[J]. 西南农业大学学报，1994，16（2）: 106-110.

[10] TAKETA S， HARRISON G E， HESLOP-HARRISON J S. Comparative physical mapping of the 5S and 18S-25S rDNA in nine wild Hordeum Species and cytotypes[J]. Thretical and Applied Genetics， 1999，98: 1-9.

[11] THOMAS H M， HARPER J A， MORGAN W G. Gross chromosome rearrangements are occurring in an accession of the grass Lolium rigidum[J]. Chromosome Research，2001， 9: 585-590.

[12] PEDROSA A， GUERRA M， SOARES FILHO W DOS S. A hierarchy of activation of nucleolar organizer regions in Citrus sinensis （L.）[J] .Osbeck Cytobios， 1997， 92: 43-51.

[13] LIU Bo， CHEN Cheng-bin， LI Xiu-lan， QI Li-wang， HAN Su-ying. Karyotype analysis and physical mapping of 45S rDNA in eight species of Sophora， Robinia and Amorpha[J]. Acta Botanica Yunnanica， 2005 ，27（3）:261-268.

刘博，陈成彬，李秀兰，齐力旺，韩素英. 豆科三属八种植物的核型及rDNA定位研究[J]. 云南植物研究，2005，27（3）: 261-268.

[14] AVIVI L， FELDMAN M， BUSHUK W. The mechanism of somatic association in common wheat， Triticum aestivum L.Ⅰ. Suppression of somatic association by colchicine[J]. Genetics，1969，62: 745-752.

[15] SINGH R J，ROBBELEN G，OKAMOTO M． Somatic association at interphase studied by Giemsa banging technique[J]. Chromosome （Brel），1976，56: 265-273．

[16] RAVINDRON P N. Homologous association in somatic cells of Ornithogalum virens[J]. Cytologia，1977，42: 1-4.

[17] DAI Zhuo-hua，DIAO Fu-shan. The studies of chromosomes in Drosophila auraria comples species found in China and Japan Ⅱthe synapsis of homologous chromosomes in mitosis of Drosophila auraria complex species found in China and Japan[J]. Acta Genetica Sinica，1987，14（6）: 447-454.

戴灼华，刁福山. 中国金色果蝇复合种的染色体研究Ⅱ中国及日本金色果蝇复合种的体细胞同源染色体联会[J].遗传学报，1987，14（6）: 447-454.

[18] ASHLEY T. Specific end-to-end attachment of chromosome in Ornithogalum virens[J]. J Cell Sci， 1979， 38: 357-367.

[19] GODIN D E，STACK S M. Homologous and nonhomologous chromosome associations by interchromosoal chromatin connectives in Ornithogalum virens[J]. Chromosoma. 1976，57（4）: 309-318.

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