大黄和公丁香对致病性哈氏弧菌及其生物膜的体外抑制作用

摘要[目的]观察大黄（Rheum officinale）和公丁香（Flos caryophylli）对哈氏弧菌（Vibrio harveyi）及其生物膜（Biofilm）的体外抑制作用。[方法]采用琼脂扩散法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌的体外抑菌作用；采用倍比稀释法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）；中图分类号S941.43文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08188-03

The Inhibitory Activity of Flos caryophylli and Rheum officinale on Vibrio harveyi and Its Biofilm

LI Jiaqin， PANG Huanying et al（Fisheries College of Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088； Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals， Zhanjiang， Guangdong 524088； Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions， Zhanjiang， Guangdong 524088）

Abstract[Objective] To observe the inhibitory effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on Vibrio harveyi and its biofilm. [Method] The inhibitory effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on Vibrio harveyi were tested by disc agar diffusion， and the MIC and MBC were detected by the double dilution； the effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on the formation of Vibrio harveyi biofilm were measured by MTT assay. [Result] Rheum officinale had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone （DIZ） of （15.31±0.4） mm， and the MIC and MBC were 7.183 mg/ml； Flos caryophylli had inhibition effects with DIZ of （11.53±0.6） mm， and the MIC and MBC were 15.625 mg/ml， 62.5 mg/ml. Both Rheum officinale and Flos caryophylli exhibited a potent inhibitory activity against Vibrio harveyi biofilm formation （P<0.01）. [Conclusion] Rheum officinale and Flos caryophylli could significantly inhibit Vibrio harveyi and its biofilm.

Key wordsRheum officinalekl； Flos caryophylli； Vibrio harveyi； Biofilm； In vitro inhibitory activity

哈氏弧菌（Vibrio harveyi）隶属弧菌科（Vibrionaceae）弧菌属（Vibrio），是一种革兰氏阴性、发光海洋细菌，广泛分布于海洋环境中[1]，是危害水产养殖动物的重要致病菌之一。该菌能够感染中国对虾（Penaeus chinensis）[2]、文蛤（Meretrix meretrix ）[3]和大黄鱼（Pseudosciaena crocea）[4]等多种海水养殖动物，给水产养殖业造成巨大的经济损失。哈氏弧菌在水体中主要以生物膜（Biofilm）的形式生存。生物膜是细菌聚集粘结在一起分泌的黏性物质，其主要成分为多糖、核酸、脂类和蛋白等[5]。生物膜能保护细菌对抗外界危险，增强其对抗菌药物的耐受能力[6]。目前，水产养殖中主要采用抗生素等化学药物防治弧菌病，但抗生素的长期使用会使病原产生耐药性，会严重破坏养殖水域的生态环境，并且对人体健康构成潜在的威胁[7]。因此，寻找安全有效的抗菌药物是目前研究的热点之一。

中草药是我国医学宝库中最珍贵的财富之一，含有很多抗菌活性强、毒性低的有效成分。大黄和公丁香是常用的中草药，它们在防治水产动物疾病中有着广泛的应用。曹红峰等[8]证实大黄对致病性弧菌、鱼害粘球菌（Myxococcuspiscolasp.nov.）和假单胞菌（Pseudomonadaceae）等常见水产动物的病原菌有明显的抑制作用。王玉娥等[9]证实哈氏弧菌对大黄和公丁香具有较高的敏感性。但是，关于这2种中药对哈氏弧菌生物膜生成的抑制作用尚未见报道。笔者通过测定大黄和公丁香对哈氏弧菌及其生物膜的体外抑制作用，探索这2种中药的抑菌作用和抗生物膜功能，以期为今后应用中药防治由该菌引起的弧菌病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和中草药。哈氏弧菌HY99由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室分离鉴定并保存。大黄和公丁香购自湛江春天药房。

1.1.2试验仪器。SZ93自动双重双蒸水蒸馏水器，购自上海市亚荣生化仪器厂；自动高压灭菌锅（HVE50），购自日本HIRAYAMA公司；恒温培养箱，购自上海市博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台，购自济南鑫贝西生物技术有限公司；摇床，由上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；酶标仪，购自美国BioRad公司。

1.1.3主要试剂。MTT（Sigma公司）；结晶紫、冰醋酸、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、NaClDMSO（二甲基亚砜）均为国产分析纯。

1.1.4主要溶液和试剂的配制。①TSB液体培养基：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g以及NaCl 20 g，蒸馏水定容至1 000 ml（调节pH至7.2），高压灭菌，4 ℃保存。②TSA固体培养基：TSB液体培养基（琼脂粉浓度1.5%），高压灭菌后，无菌条件下倒平板，凝固冷却后4 ℃保存。③0.1%结晶紫染液：溶液A，结晶紫0.2 g、95%酒精20 ml；溶液B，草酸铵0.8 g、蒸馏水80 ml。将A、B溶液混合，滤纸过滤后短期使用。④0.85%生理盐水：称取NaCl 0.85 g，用蒸馏水定容至1 000 ml，高压灭菌后备用。⑤MTT 配制：称取MTT 0.5 g，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22 μm滤膜过滤除菌，置于4 ℃避光保存备用。⑥PBS缓冲液：A：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.44 g；B：磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.24 g，调节pH至7.4，定容1 L，高压蒸汽灭菌，室温保存。⑦33%乙酸溶液：量取33 ml冰醋酸，用蒸馏水定溶至100 ml，摇匀备用。

1.2方法

1.2.1哈氏弧菌的培养。将菌株接种在含2%NaCl的TSB中，28 ℃，180 r/min摇床培养18 h。用无菌TSB将菌悬液调节OD600nm约0.7备用。

1.2.2中草药水煎液的制备。大黄资源丰富，价格低廉，并且对哈氏弧菌及其生物膜体外抑制效果较好，可选择用于防治水产养殖动物的弧菌病。笔者只是在细菌相对稳定的生长环境中进行试验，没有考虑到环境和用药方式等对药效产生的影响，具有一定的局限性，今后仍需要在养殖环境和用药方法上进行综合研究。

安徽农业科学2014年参考文献

[1] RAMESH A，VENUDOPALAN V K.Response of enteric luminous bacteria to environmental conditions in the gut of the fish[J].J Appl Bacteriol，1989，66（6）：529-533.

[2] 王斌，李华，何幽峰.引起中国对虾红腿病的两种新病原菌的研究[J].大连水产学院学报，1993，8（2/3）：43-48.

[3] 刘连生，闫茂仓，赵海泉，等.哈氏弧菌文蛤分离株WG1702培养条件优化研究[J].水产科学，2010，29（2）：79-82.

[4] 石亚素，童国忠，薛超波，等.舟山养殖大黄鱼烂尾病中哈氏弧菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国卫生检验杂志，2005，15（3）：267-269.

[5] COSTERTON J W，STEWART P S，GREENBERG E P.Bacterial biofilms：a common cause of persistent infections[J].Science，1999，284（5418）：1318-1322.

[6] 向丽，周铁军，叶迎春，等.诃子鞣质对白色念珠菌及其生物被膜的影响[J].重庆医学，2013，42（2）：134-137.

[7] ALCAIDE E，BLASCO M D，ESTEVE C.Occurrence of drug-resistant bacteria in two European eel farms[J].Appl Environ Microbiol，2005，71（6）：3348-3350.

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