内皮型一氧化氮合酶Glu298Asp基因多态性与老年原发性高血压微量白蛋白尿的关系

[摘要] 目的 研究内皮型一氧化氮合酶（eNOS）Glu298Asp基因多态性与老年原发性高血压（EH）微量白蛋白尿（MAU）的关系。方法 从到医院就诊的老年EH患者中筛选出202例无显性蛋白尿的患者，行24h MAU测定，并应用基因芯片技术检测eNOS Glu298Asp基因多态性，按照24hMAU定量分为MAU组和非MAU组（NAU组），比较两组基因型和等位基因分布差异。 结果 两组等位基因和基因型的分布不同，MAU组等位基因T及含等位基因T的基因型（GT+TT）分布频率明显升高（x2=6.62 ，P<0.01；x2=7.29，P<0.01）；T等位基因变异使老年EH患者MAU的相对危险度显著增高（OR=2.361，95%CI=1.256～4.437）。结论 T等位基因是老年EH患者MAU的易感基因，携带T等位基因导致老年EH患者出现MAU的风险显著增高。

[关键词] 内皮型一氧化氮合酶；基因多态性；老年原发性高血压；微量白蛋白尿

[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）18-23-04

原发性高血压（essential hypertension，EH）是遗传易感性和环境因素相互影响所致的全身性疾病。EH人群中有相当数量的人合并微量白蛋白尿，（microalbuminuria，MAU）的出现是全身性血管内皮受损的标志，也是EH患者亚临床心血管病变（靶器官损害）的早期标志[1]。老年人血压波动大，合并症多，更易导致靶器官损害，内皮基因多态性与EH并发蛋白尿之间的关系国内未见报道。本研究从基因水平上就老年人血管内皮与EH并发蛋白尿之间的关系作一探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对2008～2013年到我院就诊的老年（年龄≥60岁）EH患者进行内皮型一氧化氮分酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）Glu298Asp基因多态性分析并晨尿尿常规检查，排除显性蛋白尿的患者202例入选本研究。其中男103例，女99例；年龄（73.3±7.6）岁。对入选病例进行24h尿白蛋白排泄率（24hUAER）检测，按照尿微量白蛋白定量分为MAU（24hUAER≥30mg）组和NAU（24hUAER<30mg）组。排除继发性高血压，糖尿病，原发性肾脏疾病，风湿免疫性疾病，泌尿系结石，高尿酸血症及药物引起的肾脏损害等。

1.2 方法

1.2.1 尿微量白蛋白定量分析 收集早晨7时至次晨7时的24h尿量，采用放射免疫法进行24hUAER定量检测，30mg/L≤24hUAER<300mg/L为MAU组，24hUAER<30mg/L为NAU组，符合以上条件的患者入选本实验。24hUAER≥300mg/L为显性蛋白尿，应排除在外。每位患者均在不同时间接受3次检验，取其平均值。

1.2.2 基因分析 基因多态性检测用上海百傲生物技术有限公司提供的基因芯片检测eNOS Glu298Asp等位点基因多态性（等位基因298Glu简写为E，298Asp简写为D）。检测方法如下：（1）抽取被检者肘静脉血2mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。（2）用快速裂解法提取基因组DNA。采用聚合酶链反应（PCR）扩增eNOS基因的特异片段：向各扩增液管中加入Taq酶管溶液0.8mL后，分别加入阴性对照管溶液、阳性对照管溶液或抽提好的样品上清液，混匀，再放入PCR仪中，按下列条件扩增：94℃25s，56℃25s，72℃25s，做40个循环，最后72℃延伸5min。取各管PCR扩增产物于98℃热变性5min，取出后迅速放入冰盒，-20℃放置。（3）杂交、显色及结果检测在杂交仓中基因芯片与已变性PCR扩增产物混合物混匀杂交。向杂交仓中加入显色液溶液，44℃放置40min。将显色载玻片置于BaiO基因生物芯片只读仪上进行检测，图像Array Doctor软件分析可自动输出检测结果，最后检测出eNOS基因的多态性位点。

1.3 统计学分析

应用SPSS15.0统计软件进行数据分析。各组间计量资料的比较t检验，结果以（）表示；计数资料比较采用x2检验；基因型及等位基因的相对危险度以优势比（OR）及95%可信区间（CI）表示。

2 结果

2.1 两组的基因型分布频率符合Hardy-winberg平衡

对MAU组和NAU组的eNOS Glu298Asp进行基因多态性遗传平衡检验，基因型分布测定值与预计值比较，进行x2检验。两组的基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律（P>0.05），表明标本具有群体代表性。

2.2 两组临床资料比较

两组的年龄、性别、吸烟率、高血压病程、腰围/臀围（WHR）、体重指数（BMI）及总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 患者临床基线资料特征（）

组别MAU组NAU组P

性别（男/女）97（48/49）105（55/50） 0.68*

吸烟（%）32.027.6 0.50#

年龄（岁）73.01±7.74773.54±7.4590.62

TG（mmol/L） 2.085 8±0.583 93 2.051 5±0.637 780.69

TC（mmol/L） 4.953 9±1.061 28 4.922 3±1.036 490.83

LDL-C（mmol/L） 3.344 8±1.040 23 3.378 6±0.829 890.80

BMI（kg/m2）24.243 6±1.168 7724.454 7±1.121 660.19

WHR 0.799 0±0.047 49 0.802 5±0.048 890.60

EH病程（年）14.350 5±8.536 7414.857 1±6.964 790.64

注：*x2=0.169；#x2=0.455

2.3 MAU组与非MAU组eNOS Glu298Asp基因分布频率的比较

在本检测结果中，因TT基因型例数太少（见表2），TT和GT基因型被合并处理（见表3）。经χ2检验，MAU组T等位基因及含T基因型比例高于NAU组，差异有统计学意义（前者P<0.05，后者P<0.01）。与不携带T等位基因相人群相比较，携带T等位基因的人群发生MAU危险性高（OR=2.361，95%CI=1.256～4.437）。见表2。

3 讨论

EH患者，特别是老年人，多存在胰岛素抵抗，eNOS活性减弱，一氧化氮合成及释放减少，内皮依赖性血管舒张功能严重受损，血管床的紧张性、血管壁的通透性增高，肾脏血管痉挛收缩，肾血流下

降、肾小管重吸收功能减退而出现蛋白尿[2]。目前的研究也证实了内皮依赖性舒张功能与MAU的发生密切相关[3]。

本研究将eNOS基因第7外显子Glu298Asp（G894T）突变作为筛查目标，探讨单基因突变与老年高血压患者MAU易感性的关系。本研究结果显示，与非MAU组相比较，MAU组Glu/Asp基因型的分布频率有显著差异，eNOS基因298Glu→Asp变异显著增加老年EH患者MAU的危险，多因素回归分析显示MAU与Glu/Asp基因的分布频率有关，而且排除高血压因素的影响后仍有意义。有学者认为，eNOS基因外显子7上894位核苷酸位点G→T的突变，导致构象由α螺旋变为紧密折叠[4]，从而影响eNOS的功能，NO生成减少，导致内皮功能受损。eNOS辅因子（如NADPH）缺乏可能与患者NO合成减少有关[5-7]，由于eNOS以NADPH为辅酶，eNOS基因的298Glu/298Asp基因型存在时，可能由于消耗了大量的NADPH，导致NO生成进一步减少，从而促进心、肾微血管床的损害。

目前关于eNOS基因Glu298Asp多态性与MAU的关系国内外报道不一。董砚虎[8]，付正菊[9]，Young Shin Shin[10]，Intissar Ezzidi等[11]研究认为，eNOS基因第7外显子G894T点突变可能与糖尿病肾病的进展有关。而Hiroyuki Tamemoto[12]，Dell"Omo G等[13]研究则认为，eNOSGlu298Asp基因的GluAsp或AspAsp基因型与白蛋白尿无关。Jachymova等[14]发现捷克高加索人群eNOS基因的Glu298Asp多态性可能是患者对传统降压治疗的抵抗因素之一，T等位基因可能是患者的治疗反应的预测因素。Chen等[15]研究发现，eNOS基因G894T多态性与白人的EH危险、胰岛素抵抗有关。Srivastava等[16]研究认为Glu298Asp基因多态性与亚洲人高血压相关。Khawaja等[17]研究包括146例高血压和186例对照者的研究未发现G894T与巴基斯坦成人高血压相关。

目前有关MAU易感基因的研究较多，结果不一。MAU可能受多基因变异的共同影响，且存在人种和地域差异，单基因突变的研究很难对其靶基因进行准确判定和选择，多基因之间的相互联系已逐渐引起人们的重视。这就需要我们进行多基因联合检测，积极探讨各易感基因之间的交互作用，以期早日明确MAU的影响因素，对靶器官的损害进行早期防治。

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（收稿日期：2014-05-12）

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