直链烷基苯磺酸盐LAS降解菌株的筛选

材料

2.1.1 药品与试剂

玻璃棒；牛皮纸；接种环；酒精灯；滴管；镊子；剪刀；标签纸；滤纸；载玻片。

2.1.3 实验仪器

超净工作台、752 N型紫可见外分光光度计、摇床（全温型恒温培养振荡器1个，THZ-82恒温振荡器3个）、恒温培养箱（MJX-160B-Z）、pHS-3C型pH计、电子天平、制水机、立式蒸汽压力灭菌锅、离心机、电炉、显微镜。

2.1.4 培养基的配制

①富集培养基：

酵母膏1.5 g、KC1 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、LAS0.15 g、Na2HPO4·12H2O 0.07 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 1 g、蒸馏水1 000 ml，pH7、121 ℃高压灭菌20 min。

②分离培养基：

蛋白胨0.5%、NH4NO3 0.5%、K2HPO4 0.1%、KH2PO4 0.1%、NaC1 0.5%、LAS 0.15 g、pH7、121 ℃高压灭菌20 min。

③发酵培养基：

成分同富集培养基，成份含量由实验所需条件决定，121 ℃高压灭菌20 min。

2.1.5 溶液的配制

①浓H2SO4（分析纯）和50 gNaH2PO4·2H2O，定溶。

②十二烷基苯磺酸钠（DOSO3Na）标准储备液0.5g/L：

称取0.5 g十二烷基苯磺酸钠溶解于适量的蒸馏水中，然后加入到1 000 ml容量瓶中，定溶。

③十二烷基苯磺酸钠（DOSO3Na）标准工作液：

取2.0 ml十二烷基苯磺酸钠（DOSO3Na）标准储备液至

1 000 ml容量瓶中，定溶。

④结晶紫溶液1.0 g/L：

称取100 mg结晶紫，溶于适量的蒸馏水中，转移至1 000 ml容量瓶中定溶为100 mg/L。取100 mg/L的结晶紫溶液10 ml于1 000 ml容量瓶，定溶。

⑤磷酸缓冲液pH7.0：

取0.1 mol磷酸氢二钠600 ml和0.1 mol磷酸二氢钾400 ml，混合成1 000 ml溶液。

2.2 方法与步骤

2.2.1 菌种的训化与富集

从某居民生活区的下水道，采集长年受含洗涤剂废水污染的污泥。配制1 000 ml富集培养基，分别等量加入到10个250 ml的三角烧瓶中，即每个烧瓶中的液体培养基量为100 ml。称取2 g污泥，分别加入到含有LAS（0.15 g/L）富集培养基的250 ml三角烧瓶中。在摇床中30 ℃，120 r/min条件下振荡培养5 d。

培养5 d后，从摇床取出静置沉淀后，用注射器取菌液10 ml至含有新鲜培养基中（LAS量加倍，0.30 g/L）的10个250 ml烧瓶中，新鲜培养基的量同样为100 ml。

在相同条件下（30 ℃，120 r/min）在摇床中继续培养。这样连续重复4次，LAS量加倍不断加倍，驯化LAS降解菌，可以得到对LAS耐受性较高的降解菌。

2.2.2 菌种的分离与纯化

①将富集后的菌液在琼脂平板上进行涂布，放入恒温培养箱，在30 ℃条件下培养2 d。

②待长出旺盛的菌落以后，挑取菌落在琼脂平板上画线分离。同样在30 ℃条件下，放入恒温培养箱培养。

③挑取生长旺盛的典型单菌落，再次在琼脂平板上画线分离、培养。这样经反复纯化，获得能以LAS为唯一碳源生长的菌株，命名为A-1。

2.2.3 培养液的接种

①取出已分离出的菌种，以10 ml无菌水洗下菌苔，充分摇匀打散，制成浓菌液。

②向每瓶培养液中接人菌液1.0 ml，在研究所需要的不同条件下进行恒温振荡培养。

2.2.4 A-1降解率的测定

在250 ml的三角烧瓶中加入含有不同LAS浓度100 ml液体培养基，高温灭菌后接种一定量的LAS降解菌（A-1），放入30 ℃的恒温摇床中120 r/min培养，定时采取样测定测定LAS的含量，计算A-1的降解效果。

①测定方法：

取1.0 ml经过滤的样品溶液，稀释至100 ml，取2.0 ml，于10 ml比色皿中。然后加入1.0 mlpH为7.0的缓冲溶液和3.0 ml结晶紫溶液，用水稀释至刻度，摇匀，放置20 min。在室温条件下，以试剂空白溶液作参比，用10ml的比色皿于580 nm波长处测定吸光值。（注意试剂的加入顺序为待测样品（DOSO3Na），缓冲液，显色剂（结晶紫溶液），否则灵敏度偏低。）

②分析计算方法：

在选定的实验条件下，DOSO3Na浓度在0～20 mg/L范围内与吸光度A值呈良好的线性关系，校正曲线的回归方程为A=0.7523 CDOSO3Na（mg/L）+0.0322，相关系数，r=0.9947，对0.1 mg/L的DOSO3Na溶液重复测定11次，回收率为96～103，且RSD<3.7。

3 结果与讨论

3.1 分离筛选结果

经过分离筛选获得了一株以LAS为唯一碳源生长的菌株，命名为A-1。该菌在显微镜下，如图1所示。

3.2 A-1不同浓度下的降解率的测定

分别配制50 mg/L，100 mg/L，150 mg/L，200 mg/L，250 mg/L 5种浓度的液体培养基，每个浓度3份。

接种后在30 ℃条件下，以120 r/min在摇床中恒温振荡培养，每隔一段时间测定培养基中LAS的浓度。

各个时间为接种后的：12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、120 h。测得的OD580值的平均值，见表1。

由图2可以看出，在时间0～12 h之间降解率很小，在12～48 h之间时，降解率上升的很快，此后降解率的变化就很小了。这个规律与该LAS降解菌A-1的生长规律基本是同步的。

此外还发现，不同浓度的LAS对A-1的生长影响很大，低浓度下的讲解率比高浓度下的大，这跟LAS对微生物的毒性有一定关系[3]。

4 结 语

①该菌对LAS有很强耐受性，在4 000 mg/L的LAS浓度下，该菌仍能生长。

②该菌的生长速度比较快，在48 h内能达到最高生长量。

③通过该菌对LAS降解率的研究，发现该菌在低浓度的LAS下，有较高的降解率。并且，其降解率随着LAS浓度增加而降低。

LAS是一种极难降解的环境污染物，要更彻底地对LAS进行降解，可以对现有的对LAS具有降解能力的菌株进行诱导或可以利用基因工程技术于构建降解LAS的基因工程菌来提高难降解LAS处理效率。同时也需要研发新的更好产品来替代LAS，减少LAS的使用量。

参考文献：

[1] 姜安玺，夏冰，李亚选.表面活性剂LAS废水处理研究进展[J].安全与环境学报，2004，（4）.

[2] 吴楚.一株十二烷基苯磺酸钠降解菌的分离鉴定及降解特性研究[J].微生物学报，2006，（12）.

[3] 范凤申，张忠祥，孙孝然.LAS的可生物处理性及其对大型毒性的试验研究[J].环境科学，1988，（9）.

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