白藜芦醇对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制作用与PI3K—Akt信号通路的关系

［摘要］　目的：探讨白藜芦醇对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响及与PI3KAkt信号通路的关系。方法：50只成年雄性SD大鼠，随机分为5组，即对照组（SH组）、缺血再灌注组（I/R组）、白藜芦醇预处理组（Res组）、白藜芦醇预处理+渥曼青霉素组（Res+Wom组）、缺血再灌注+渥曼青霉素组（I/R+Wom组）。结扎冠状动脉左前降支制备心肌缺血模型，缺血45　min，再灌注120　min，测定再灌注心肌组织中NOS，NO的含量，并用末端脱氧核苷酸转移酶介导的带生物素的dUTP缺口末端标记（TUNEL）的方法测定细胞凋亡，免疫组化测定心肌组织中Bcl2，Bax蛋白的表达，利用Western　blot测定Akt（又称PKB，即蛋白激酶B）及pAkt（即磷酸化蛋白激酶B）含量。结果：与I/R组及Res+Wom组比较，Res组NOS及NO表达增加，显著减轻心肌细胞凋亡，Bcl2蛋白表达显著升高，Bax/Bcl2降低，Akt的磷酸化水平增高，上述各项指标差异具有统计学意义（P<0.05），而上述变化能够被PI3KAkt信号通路的特异性阻断剂渥曼青霉素所阻断，且其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：白藜芦醇能够抑制缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡，此过程有PI3KAkt信号通路的参与。

［关键词］　白藜芦醇；心肌缺血再灌注损伤；细胞凋亡；PI3KAkt　信号通路

［稿件编号］　20110803014

［通信作者］　*刘新伟，教授，硕士生导师，主任医师，主要从事老年麻醉和体外循环心肌保护研究，Tel：13752889968

［作者简介］　何东伟，硕士研究生，主要从事心肌缺血再灌注损伤和心肌保护研究，Email：603155458@qqcom 白藜芦醇（resveratol）是植物体内一种天然的二苯乙烯类多酚物质，其化学名为3，4，5三羟基酚，国内外研究表明，白藜芦醇可降低血小板聚集，对心血管疾病具有预防作用，是一种抗自由基、抗氧化剂，但其具体的作用机制尚不清楚。在心肌缺血再灌注损伤过程中，心肌损伤的发生是多因素多途径的。研究证明，阻断心肌损伤级联反应中的关键环节和抑制参与多信号途径的介质是防治心肌损伤和细胞凋亡的最有效方法，而磷脂酰肌醇3激酶丝氨酸/苏氨酸激酶（phosphatidylinositol3kinaseserine/threonine　kinase，PI3KAkt）信号通路是细胞内重要的信号转导通路，在对抗心肌缺血再灌注损伤、抑制细胞凋亡中发挥重要作用[1]。本实验观察白藜芦醇预处理对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响及其与PI3KAkt信号通路的关系，探讨白藜芦醇保护缺血心肌的作用机制。

1　材料

1.1　动物　健康成年雄性SD大鼠50只，体重220～250　g，由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2　药品、试剂及仪器　白藜芦醇购自四川维克奇生物科技有限公司，纯度≥98％，批号201004，使用前用二甲基亚砜（DMSO）溶解并以生理盐水稀释至所需浓度，目前研究证实白藜芦醇没有明显的不良反应，大鼠试验中，最大剂量给到500　mg·kg-1也未发现明显的不良反应，综合国内外文献，目前普遍使用的实验剂量是10～40　mg·kg-1，本实验采用的剂量为20　mg·kg-1。渥曼青霉素、一氧化氮（NO）检测试剂盒、一氧化氮合酶（NOS）检测试剂盒、原位细胞凋亡检测试剂盒、免疫组化抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。动物人工呼吸机DH40（浙江大学实验仪器厂）；RM6000八导生理记录仪（日本光电公司）。

2　方法

2.1　分组　将50只SD雄性大鼠，随机分为对照组（SH组）、缺血再灌注组（I/R组）、白藜芦醇预处理组（Res组）、白藜芦醇预处理+渥曼青霉素组（Res+Wom组）、缺血再灌注+渥曼青霉素组（I/R+Wom组），每组10只。

2.2　模型制备　SD健康大鼠术前禁食6　h，在1.55　mol·L-1乌拉坦5　mg·kg-1静脉麻醉，仰卧位固定大鼠，标准Ⅱ导联心电图监测，连接气管插管待开胸后连接人工呼吸机（潮气量20　mL·kg-1，频率50次/min）。在胸骨左缘0.5　cm处纵行切开第3～5肋，剪开心包，暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支，同时将一根直径2　mm塑料管置于结扎线和冠状动脉之间，拉近结扎线使塑料管压迫引起冠脉闭塞，造成急性心肌缺血模型，观察心电图，以出现QRS波群高达增宽为结扎成功的标志。缺血45　min后，取出塑料管即再灌注，以QRS波群振幅逐渐回落为再灌注成功标志，进行再灌注120　min，假手术组的动物手术全过程与其他组相同，但只穿线不结扎冠脉[2]。

2.3　给药方法　假手术组：冠状动脉左前降支只穿线，不结扎，穿线时由舌静脉注入生理盐水1　mL。缺血再灌注组：结扎左冠状动脉前降支45　min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120　min，结扎前1　min由舌静脉注入生理盐水1　mL。白藜芦醇预处理组：结扎前1　min由舌静脉注入白藜芦醇20　mg·kg-1，即1　mL所配溶液。渥曼青霉素加白藜芦醇预处理组：结扎前1　min由舌静脉注入白藜芦醇20　mg·kg-1，即1　mL所配溶液及渥曼青霉素。渥曼青霉素加缺血再灌注组：结扎前1　min由舌静脉注入1　mL生理盐水及渥曼青霉素；各组除所加药物不同外其余处理同假手术组。

2.4　心肌组织NOS，NO含量的测定　一氧化氮合酶（NOS）测定采用催化LArg比色法；NO采用硝酸酶还原法测定。

2.5　心肌凋亡细胞原位检测　再灌注结束，迅速剪下心脏，置于冰的PBS液中洗净残血，分离左心室前壁，于4%的多聚甲醛固定12　h，石蜡包埋。应用TUNEL凋亡测试试剂盒，严格按照原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。主要流程如下：切片脱蜡脱水，蛋白酶K（20　mg·L-1）消化15　min，1%过氧化氢/甲醇溶液封闭内源性过氧化酶（POD）5　min，加20　μL　TdT盒带地高新的标记液，37　℃，1　h，加POD转换液，37　℃，30　min，二氨基联苯胺（DAB）显色、苏木精复染、水洗、封片、镜检。上述步骤不加TdT为阴性对照。光镜下正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核为深浅不一的棕褐色，每张切片于缺血部位随机选取8个高倍视野（×400倍），分别记数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数并进行汇总，以凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比作为凋亡指数（apoptotic　index，AI）。

2.6　心肌组织Bcl2，Bax蛋白表达的免疫组化测定　每一标本取2个不同部位的切片各2张，采用链酶亲和素生物素酶复合物（strept　avidinbiotin　compiex，SABC）免疫组化检测Bcl2，Bax蛋白的表达。主要流程如下：切片脱蜡入水，1％过氧化氢封闭POD　10　min，加山羊血清封闭，加Bcl2，Bax蛋白的抗体，4　℃过夜，滴加小鼠抗地高新，再滴加生物素化养抗小鼠IgG，37　℃　30　min，加SABC，用DAB显色、苏木素复染、水洗、封片、镜检。阴性对照不加抗体，阳性对照用已知阳性片，阳性判断标准：以细胞浆着棕黄色为阳性，用计算机图像处理系统，每次随机选10个视野，测定细胞阳性染色的A与阳性细胞百分比，计算蛋白阳性表达指数（posiive　expression　index，PEI），PEI=A×阳性细胞百分比×100，并计算Bax和Bcl2的比值。

2.7　Western　blot测定Akt及pAkt的蛋白表达　左心室心肌的缺血区，置于液氮中冻存后转至-70　℃存放。称取冻存心肌样品0.1　mg，冰浴，加入500　μL组织裂解液，冰浴匀浆，4　℃，12　000　r·min-1离心10　min，收集上清50　μL应用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。余下上清加入4×loading　buffer，封闭后100　℃水浴10　min，-70　℃保存。以每个样品的总蛋白为20　μg上样，进行SDSPAGE凝胶电泳（浓缩胶为5%，分离胶为12%，120　V/140　V），BioBad干转仪（≤90　mA）转膜至PVDF，2%脱脂奶粉封1　h，一抗体封闭4　℃过夜。PBST（PBS+聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯即吐温20，1/1　000）洗膜15　min×3次；二抗（1∶4　000）37　℃孵育1　h（羊抗兔），PBST漂洗后用增强化学发光法检测蛋白表达，凝胶成像系统成像，应用UVP凝胶图像处理系统Labwork　46软件分析目的条带的灰度值。

2.8　统计学处理　采用SPSS　130统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，两两比较采用SNKq检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1各组心肌组织中的NOS，NO的含量　与I/R组比较，Res组NO和NOS的含量明显增加（P<0.05）；　Res+Wom组和I/R+Wom组差异无统计学意义；与Res组比较Res+Wom组和I/R+Wom组NO，NOS的含量明显降低（P<0.05），见表1。

3．2　各组大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响　用TUNEL法染色的阳性的心肌细胞具有形态变圆或不规则、与周围组织脱离、核固缩、染色质浓聚等典型的凋亡细胞的形态特征，主要位于心肌梗死区与非梗死区交界处，而在心肌梗死区和非梗死区内仅见极少数散在凋亡细胞。与I/R组相比，Res组AI显著降低（P<0.05）；阻断剂渥曼青霉素组与Res组相比，AI显著升高（P<0.05），阻断剂渥曼青霉素组与I/R相比AI无显著差别。

3.3　各组心肌组织中Bcl2，Bax蛋白表达的影响　Bcl2和Bax蛋白表达的部位与凋亡细胞十分相似。与I/R组相比，Res组Bcl2蛋白表达显著升高（P<0.05），Bax/Bcl2低于I/R组（P<0.05），加入PI3KAkt信号通路的特异性阻断剂渥曼青霉素后，与Res组相比，Bcl2蛋白表达显著降低（P<0.05），Bax/Bcl2高于Res组。Res+Wom组与I/R组及Wom组相比，Bcl2蛋白的表达无显著差异，Bax/Bcl2无显著性差异，见表2。

3.3　各组总Akt及pAkt的表达量　各组总Akt差异无统计学意义；与I/R组比较，Res组pAkt蛋白表达明显增加（P<0.05）；与Res组比较，Res+Wom组和I/R+Wom组pAkt蛋白表达水平降低（P<0.05），见表3。

4　讨论

Maroko[3]等研究发现，细胞凋亡是心肌缺血时心肌损伤的主要形式，心肌细胞的凋亡程度决定了心肌梗死面积的大小。最初的研究大多从被动途径探讨心肌保护的机制，比如通过减少中性粒细胞的聚集、改善冠状动脉内皮功能、减少活性氧的产生及降低线粒体钙离子浓度等。后来的研究表明，在致死性缺血再灌注之初，各种心肌保护手段能够主动募集信号转导通路，特别是磷脂酰肌醇3激酶丝氨酸∕苏氨酸激酶（PI3KAkt）信号通路。目前认为，主动效应在心肌保护作用中可能占据着更重要的位置[1]。

白藜芦醇的心血管保护作用机制涉及抑制血小板聚集合组织因子的表达[4]、促进血管舒张、抑制脂质过氧化[5]、抑制血管平滑肌细胞增殖[6]等。渥曼青霉素是PI3KAkt信号通路的特异性阻断剂。实验过程观察到预先给予白藜芦醇后凋亡的心肌细胞数量明显减少，但是应用PI3KAkt信号通路的特异性阻断剂后，细胞凋亡数量明显增加（P<0.05）。NO的信号内转导途径可以与细胞凋亡的信号传递通路相互联系，抑制caspase3裂解为Bcl2，从而减少细胞凋亡[7]。Bcl2家族是主要的凋亡调控蛋白，Bcl2蛋白具有促进细胞生存，抑制细胞凋亡的作用，而Bax蛋白促进细胞凋亡，其中Bax与Bcl2的表达比例是决定细胞是否凋亡的关键。心肌缺血再灌注损伤发生后，心肌细胞Bcl2蛋白表达下降。本实验发现，白藜芦醇预处理后，心肌组织中Bcl2蛋白表达上调，Bax蛋白表达下调，Bax/Bcl2下调，心肌细胞凋亡的数量显著下降，而同时应用白藜芦醇和渥曼青霉素时，白藜芦醇的上述作用显著减弱，这一结果提示白藜芦醇减少心肌细胞凋亡的机制可能是通过上调Bcl2蛋白的表达，下调Bax/Bcl2来实现的，且有PI3KAkt信号通路的参与，此外，NO还可以通过影响缺血再灌注过程中的炎症反应过程，减少心肌细胞坏死和凋亡[8]。白藜芦醇预处理后，心肌组织中的NOS活性和NO含量上升，心肌细胞凋亡的数量显著下降。研究证实，部分心肌保护的作用机制最终依赖于Akt的活化[9]，　PI3KAkt保护心脏的机制中涉及到多种细胞内信号转到介质和效应蛋白。活化的Akt能作用于它下游的多个靶点，　并可能最终通过减少线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，来改善线粒体能量的生成，保持线粒体外膜的稳定性，减少促凋亡因子的活化等，发挥保护心肌功能，抗凋亡的作用。Western结果显示Akt的活化水平有显著的差异（P<0.05）。

由此提示白藜芦醇对心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡具有抑制效应，而这种保护作用能被渥曼青霉素所阻断，这种抑制可能与激活PI3KAkt信号通路有关，而激活后的Akt具体是如何发挥保护效应，还需进一步研究。

［参考文献］

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[8]　张峰，　罗晓星，　张涛，　等.　缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡及一氧化氮对此过程的作用[J].　中国药理学通报，　2002，　18（3）：288

[9]　Tong　H，　Chen　W，　Steenbergen　C，　et　alIschemic　preconditioning　activates　phosphatidylionsitol3kinase　upstream　of　protein　kinase　C[J]　Circ　Res，　2000，　87（4）：309［责任编辑　张宁宁］

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