吲哚在酪氨酸激酶抑制剂中的药效团作用及合成方法

摘 要： 酪氨酸激酶抑制剂是一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。该类化合物大多作为三磷酸腺苷与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂，阻断酪氨酸激酶的活性，抑制细胞增殖。目前已有数种酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物在临床上使用，治疗效果明显。本组致力于研究新一代的血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂——贝雷文尼及其衍生物，本文主要研究贝雷文尼结构上重要的吲哚类药效团及其合成方法。

关键词： 酪氨酸激酶抑制剂 血管内皮生长因子受体 贝雷文尼 吲哚药效团 化学合成方法

一、前言

21世纪，随着科学技术的不断发展，人类已经战胜了一些以往难以治愈的疾病。但是，被称为“世纪之魔”的癌症，已经成为全球范围内的常见病和多发病［１］，其死亡率之高，使其成为继心脑血管疾病之后的又一类杀手。癌症（Cancer），亦称恶性肿瘤（malignant neoplasm），为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控之外，还会局部侵入周遭正常组织，甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。

卫生部《中国卫生统计提要》的数字显示，2003年以来，癌症连续在城市居民死因中位居首位，是严重危害居民健康和生命的疾病。自2006年6月起，卫生部和科技部联合组织了第三次全国死因回顾抽样调查。20世纪70年代，我国每年死于癌症的人口约70万。20世纪90年代，我国每年死于癌症的人口约为117万。21世纪初，我国每年死于癌症的人口约为150万。如不加以控制，中国癌症死亡人数在今后20年中就将超过400万，而癌症患者总数将达660万。

随着癌症在全球范围内的肆虐，治疗方法也在不断更新，其中包括外科肿瘤学的治疗、放射肿瘤学的治疗、癌症化疗、癌症的化学预防、大剂量化疗、癌症免疫治疗和综合治疗等。其中，癌症的治疗方法一直是以外科手术、放射治疗、化学疗法为主的。药物治疗因其治疗范围有限——大部分癌症是无法用药物来治疗的，只有有限的几种可以使用，效果没有一线疗法好，所以一直处于辅助的治疗地位。但是，从癌症产生的那一天起，人类就没有放弃过使用药物治愈癌症的希望，但因为科学传统技术的制约问题，一直没有长足的进步。随着近代生命科学和合成化学的发展，出现了一批有代表性的常用抗肿瘤药，其中包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物来源的抗肿瘤药物等，多数是现今临床正在被使用的品种。传统的抗癌药也多是细胞毒药物，不仅对癌细胞有杀伤作用，而且对正常的人体组织细胞有极大的破坏作用，产生很大的副作用，患者生活质量明显下降，人类对靶向给药的抗癌药有着急切的需求。

酪氨酸激酶抑制剂为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷（ATP）与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂，也可作为酪氨酸的类似物，阻断酪氨酸激酶的活性，抑制细胞增殖，已经开发为数种抗肿瘤药物。

二、文献综述

（一）酪氨酸激酶抑制剂

现在研究较多的蛋白激酶抑制剂包括表皮生长因子受体酪氨酸激酶、血管内皮生长因子受体抑制剂等。下面我们以表皮生长因子受体酪氨酸激酶（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）为例进行综述。

EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）的家族成员之一。该家族包括HER1（erbB1，EGFR），HER2（erbB2，NEU），HER3（erbB3）及HER4（erbB4）。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。

EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失、其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。

EGFR是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR（ErbB-1），HER2/c-neu（ErbB-2），Her3（ErbB-3）和Her 4（ErbB-4）。EGFR也被称作HER1，ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170Da。

EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括EGF和TGFα。激活后，EGFR由单体转化为二聚体，尽管也有证据表明，但激活前存在二聚体。EGFR还可能和ErbB受体家族的其他成员聚合来激活，例如ErbB2/Her2/neu。

EGFR二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路，包括Y992，Y1045，Y1068，Y1148 and Y1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化，包括MPAK，Akt和JNK通路，诱导细胞增殖，受体激活对于皮肤的免疫来说很重要。

研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关，其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活，等等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关，一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括：具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，它们的共表达往往预示肿瘤预后不良。例如，在乳腺浸润性导管癌的研究中发现，TGFα与EGFR共表达，且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。

此外，对EGFR与肿瘤的血管生成、高侵袭性及转移关系的研究发现EGFR可以通过Ang-1及VEGF等因子水平的调节而影响肿瘤血管生成。

在配体与表皮生长因子受体（EGFR）结合后，受体发生了二聚作用，二聚作用既包括两个同种受体分子的结合（同源性二聚作用），又包括人类EGF相关性受体（HER）酪氨酸激酶家族中的不同成员的结合（异源性二聚作用）。二聚作用后是酪氨酸残基的自磷酸化作用。这些磷酸化的残基是募集适配蛋白和额外的酪氨酸激酶底物的结合位点。蛋白质在激活的受体复合物中相互作用刺激ras蛋白，引起磷酸化级联反应的发生和丝裂原激活蛋白（MAP）激酶的激活，或者转录信号传导和激活、磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K）-Akt和应激活化蛋白激酶（SAPK）信号传导通路将被激活。这些信号通路依次触发基因转录，同时控制细胞增生、分化和生存的通路被激活。EGFR介导信号通路的特异性和强度取决于激活蛋白的性质和四种EGFR家族成员的水平。与HER2结合的配体不详，但当HER2和EGFR共表达时，前者经常与配体激活的后者结合形成二聚体。这种异源性二聚体与EGFR同源性二聚体相比，往往具有更高的再利用率、稳定性和传导信号的能力。EGFR也能与HER3和HER4发生二聚作用，其产物具有更高的持久性和更强的PI3K活性。EGFR信号传导通路一旦配体结合的EGFR被内吞入细胞，信号就将终止，受体将被降解或再循环到细胞膜表面，这取决于配体的性质。例如，EGF结合的受体将被降解，而TGF-α结合的受体则进入再循环。不同的生长因子会影响EGFR信号通路的数量和持续时间。EGFR信号通路有多重的生物学作用。例如，Ras-MAPK信号转导通路刺激细胞的分裂和迁徙。EGFR也是多种受体通路的重要介体，起到信号会聚点的作用，能够将信号整合和多样化。例如，在应激、膜解聚作用和一些非生理性刺激物（包括氧化剂、放射线和烷化剂）的反应中，反向激活能诱导EGFR酪氨酸激酶的磷酸化并随后发生信号的转导。EGFR家族的成员在正常发育中起了重要的作用，但在人类肿瘤中经常过度表达并失去控制。

（二）吲哚衍生物

吲哚环化合物是重要的有机原料和化工产品，近年来吸引了越来越多的化学家的关注。吲哚环化合物不仅可以合成染料、制备香料，还可以用作植物生长素、饲料添加剂，而且可以治疗心血管病、糖尿病及肺癌等多种疾病，因此它在工业、农业及医药等领域中有着十分广泛的重要用途。随着人们对吲哚环化合物用途认识的深入，对吲哚环化合物合成方法的研究也越来越多，现在每年都有不少关于这方面的报道。褪黑素是典型的吲哚生物碱药物。褪黑激素（Melatonin）主要是由哺乳动物和人类的松果体产生的一种胺类激素，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。

N-乙酰基-5-甲氧基色胺

褪黑激素的生物合成：松果体在光神经的控制下，由色氨酸转化成5-羟色氨酸，进一步转化成5-羟色胺，在N-乙酰基转移酶的作用下，再转化成N-乙酰基-5-羟色胺，最后合成褪黑激素，从而使体内的含量呈昼夜性的节律改变。褪黑素每日分泌量极少，但在昼夜调节、性成熟、生殖、免疫反应、肿瘤、衰老过程中起着重要的作用。

褪黑素的抗肿瘤作用：Vijayalaxmi等（1995）体外研究发现，褪黑激素对137Cs的γ射线（150cGy）所造成的人体外周淋巴细胞染色体损伤有明显的保护作用，且呈剂量—效应关系；对自由基产生的物理和化学致突变性和致癌性有拮抗作用。体外试验表明，褪黑激素对自力霉素C引起的致突变性也有保护作用。褪黑激素能降低化学致癌物（黄樟素）诱发的DNA加成物的形成，防止DNA损伤。

（三）吲哚药效团在酪氨酸激酶抑制剂中的应用

舒尼替尼是一种经典的酪氨酸激酶受体抑制剂，其母核中就含有吲哚结构的重要药效团。

舒尼替尼

实验证明，舒尼替尼能够抑制80多种酪氨酸激酶和多种生长因子受体，如血小板源性生长因子受体（platelet derived growth factor receptors，PDGFR）、血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptors，VEGFR）﹑I-型集落刺激因子受体（colony stimulating factor receptor type 1，CSF-1）、干细胞因子受体（stem cell factor receptor，KIT）等。

在酪氨酸激酶的肿瘤表达体系中，舒尼替尼能够抑制多种酪氨酸激酶的磷酸化过程。通过实验性肿瘤模型证实，舒尼替尼有抑制肿瘤细胞生长、退化、转移的作用。对于酪氨酸激酶调控失灵的肿瘤细胞，舒尼替尼能够抑制其生长。

舒尼替尼的靶点，如VEGF、PDGFR、raf、HIF等很多在肾癌细胞中都是高表达的。Ⅱ和Ⅲ期临床试验表明，舒尼替尼可使肿瘤稳定，受益率为70%—75%，在相当多患者中延长PFS，控制力、反应率比干扰素治疗显著提高，生存率提高，一线治疗有很好效果，二线治疗效果也很好，有非常好的应用前景。

舒尼替尼与索拉非尼治疗转移性肾癌都有很好的疗效，都是抑制血管生成和细胞增殖，靶位可能有所不同。

（四）酪氨酸激酶抑制剂——贝雷文尼

随着分子生物学技术的发展和提高，和从细胞受体及增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制的进一步了解和认识，人类开始了以关键基因、细胞受体和调控分子为靶点的治疗方法的研究，称其为“靶向治疗”。贝雷文尼正是在这样的趋势下，研究和发展起来的新一代靶向抗癌药物。

贝雷文尼

Brivanib alaninate

贝雷文尼一种分子靶向新药，是由百时美施贵宝公司（BMS）开发的。它通过抑制血管生成和诱导细胞凋亡起到抗肿瘤作用。前期临床研究表明贝雷文尼对肝细胞癌有较好的抗肿瘤效果。

贝雷文尼是一种选择性血管内皮生长因子（VEGFR）酪氨酸激酶抑制剂，该酶通常表达于上皮来源的实体瘤。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数属于致癌RNA病毒的癌基因产物，也可由脊椎动物的原癌基因产生。

酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷（ATP）与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂，也可作为酪氨酸的类似物，阻断酪氨酸激酶的活性，抑制细胞增殖，已经开发为数种抗肿瘤药物。

贝雷文尼对索拉非尼和沙利度胺治疗失败的患者有效且耐受性良好。研究还发现血清Ⅳ型胶原下降与较长的PFS、OS相关，可能是贝雷文尼治疗有效的一个生物标志物。

贝雷文尼与索拉非尼“头对头”比较一线治疗晚期HCC和贝雷文尼对照安慰剂治疗索拉非尼治疗失败或不能耐受的肝癌的两项Ⅲ期国际研究刚开展。贝雷文尼有望成为肝癌分子靶向治疗另一个可供选择的药物。

三、目标化合物设计

合成路线与条件：（1）乙酰乙酸乙酯，钠氢，浓硫酸，室温，12小时；（2）氯化苄，四氢呋喃，室温，12小时；（3）钯碳，氯化铵，四氢呋喃，甲醇，室温，12小时。

路线一是本小组设计的第一条路线，因为其在实验过程中收率较低，产物在反应环境中不稳定，故最后放弃。

旧路线从表面上看来比新路线步骤少而且操作简单，但实验证明在氢气钯碳环境下吲哚产物不稳定，最后一步关环反应产率很低，所以在综合考虑已有文献和前期实验结果后，我们最终确定了一条四步的新反应路线（路线二）。

合成路线与条件：（1）乙酰乙酸乙酯，钠氢，浓硫酸，室温，12小时；（2）碳酸钾，甲醇，回流，2小时；（3）吡啶盐酸盐，180度，5小时；（4）保险粉，室温，19小时。

四、化学合成

（一）合成路线

合成路线与条件：（1）乙酰乙酸乙酯，钠氢，浓硫酸，室温，12小时；（2）碳酸钾，甲醇，回流，2小时；（3）吡啶盐酸盐，180度，5小时；（4）保险粉，室温，19小时。

（二）实验讨论

在反应步骤a中要注意原料加入的顺序，应当先加入乙酰乙酸乙酯和氢化钠拔氢，再加入原料三氟硝基苯。同时，在此步中要控制反应系统的温度不能过高。

在反应步骤b中要注意加入碳酸钾的作用是中和生成的HF，使反应不断向右进行，使反应产率变高。同时要注意加热的温度，使甲醇充分回流。

在反应步骤c中要注意吡啶盐酸盐的脱甲基作用，可用软硬酸碱理论解释。同时注意此步的后处理过程较为困难繁琐，可用优化萃取的方式，获得较高的产率。

在反应步骤d中要注意加入保险粉时需分批加入，防止强还原性的低亚硫酸钠和水大量放热，此处可用用冰水浴控温。

五、实验操作

MS用HP1100LC/MSD质谱仪测定。薄层层析（TLC）板采用硅胶GF254（烟台江民硅胶开发有限公司生产）与浓度为0.8%的CMC-Na蒸馏水溶液搅拌均匀后铺板，经100-110℃活化一小时后放置于干燥器内保存备用，于紫外灯下（波长254nm）显色；柱层析采用200-300目硅胶（烟台江民硅胶开发有限公司生产），干法装柱。试剂均为市售化学纯或分析纯产品，除特别说明外，不经处理直接使用。

（一）2-丙酮基-3，4-二氟硝基苯

2-acetone and 3，4-fluorine nitrobenzene

将钠氢（10.1g）混溶（混悬）于四氢呋喃（480mL）中，加入2L的四颈瓶，室温搅拌，随后缓慢滴加乙酰乙酸乙酯（47g，0.36mol，至反应液，内温上升至27℃后下降，此时置于冰水浴中降温，温度维持在22℃左右。溶液变为淡黄色澄清溶液。滴加三氟硝基苯（32g，0.18mol，约105滴/分钟），撤去冰浴，恢复室温，溶液呈现澄清酒红色，内温22℃，继续搅拌3小时，内温在20℃至22℃之间波动。反应结束后加氯化铵溶液调节pH值至4，溶液的红色逐渐变淡直至消失。反应液用乙酸乙酯萃取三次，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得油状物66.3g，随后加入浓硫酸50mL和乙酸62mL，70℃下反应过夜。反应结束后，加水稀释反应液，用乙酸乙酯萃取三次，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得油状物，快速硅胶柱层析得红色油状物Briva-1共27.2g，收率70.24%。

ESI-MSm/z:215［M+H］。

（二）2-丙酮基-3-氟-4-甲氧基硝基苯

2-acetone-3-fluorine-4-hydroxy nitrobenzene

将Briva-1（5g，23.24mmol），KCO（2.73g，19.75mmol）溶于甲醇溶液（3mL），加热至70℃。回流速度大约40滴/分钟，溶液深红色。2小时后回流变慢，约10滴/分钟，点板观察发现未完全反应完，将外温上调至73℃。共反应5小时，将反应液用乙酸乙酯水萃取，取乙酸乙酯层旋蒸，得棕黄色固体3.6g。收率72.67%。

mp:84.5℃

ESI-MS m/z：229［M+H］。

HNMR（CDCl，300MHz）：8.067（1H，m，HAr），6.988（1H，t，HAr），4.228（2H，d，CHAr），3.998（3H，s，CHOAr），2.371（3H，s，CH）

（三）2-丙酮基-3-氟-4-羟基硝基苯

2-acetone-3-fluorine-4-oxhydryl nitrobenzene

将Briva-2（3g，13.2mmol）和吡啶盐酸盐（6.1g，52.82mmol）放入三颈瓶中，180℃加热，固体融化为黑色液体。5小时后，溶液用乙酸乙酯和水萃取，取乙酸乙酯层旋干得棕黑色固体1.81g。用洗脱剂（石油醚：乙酸乙酯=6:1）柱层析得黄色的纯品1.50g，收率56.86%。

mp:167.1℃

ESI-MS m/z：213［M+H］。

HNMR（CDCl，300MHz）：7.988（1H，m，HAr），6.956（1H，t，HAr），6.494（1H，s，HOAr），4.212（2H，d，CHAr），2.408（3H，s，CH）

（四）2-甲基-4-氟-5-羟基-吲哚

2-methyl-4-fluorine-5-hydroxyl-indoles

取Briva-3（1.524g，7.15mmol）和水（33.48ml）加入50ml三颈瓶，黄色固体不溶，室温搅拌。分配加入NaSO（保险粉6.9g，39.6mmol），温度逐渐上升至36℃，冰浴降温至17℃，溶液内有黄色絮状物，20min内保险粉加完，溶液逐渐由黄色变为乳白色，内温8℃。反应过夜（19h）。溶液最终呈乳黄色，乙酸乙酯和水萃取，最终得固体（1.054g）。产率89.25%。

mp:146.7℃

HNMR（CDCl，300MHz）：10.803（1H，s，-HN-），8.684（1H，s，HOAr），6.882（1H，d，HAr），6.661（1H，t，HAr），6.055（1H，s，—CH=），2.335（3H，s，CH）

参考文献：

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