AnnexinA2和MMP—9在胃癌中的表达及其相关性

【摘 要】目的：分别检测膜联蛋白A2（Annexin A2）和基质金属蛋白酶-9 （matrix metalloproteinases-9，MMP-9）在胃癌中的表达及其相关性，探讨二者与胃癌临床病理参数之间的相关性。 方法：采用免疫组化SP方法，研究63例胃癌组织和20例正常胃黏膜组织中Annexin A2 、MMP-9的表达。结果：AnnexinA2 和MMP-9在胃癌组织中的阳性表达率为90.5%、93.7%，高于正常胃黏膜组织中的表达率35%、25%，两组之间比较差异具有统计学意义（P<0.01）。annexinA2、MMP-9在胃癌组织中的阳性表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期具有相关性（P<0.05），而与患者性别、年龄没有相关性（P>0.05）。胃癌组织中Annexin A2和MMP-9的表达具有相关性，切呈正相关（r=0.263，P <0.05）。结论：Annexin A2、MMP-9在胃癌中的表达与胃癌恶性生物学行为密切相关，研究二者在胃癌组织中的表达可为胃癌的诊断和预后判断提供新思路。

【关键词】胃癌；免疫组化；膜联蛋白A2；基质金属蛋白酶-9

胃癌是起源于胃上皮的恶性肿瘤，导致其预后差死亡率高的主要原因是其发生浸润和转移，给患者治疗带来了极大的困难，大大降低了患者的生存率。目前研究发现，膜联蛋白A2（Annexin A2）对肿瘤的侵袭和转移过程的影响主要通过调节细胞内F.actin细胞骨架及与细胞外各种蛋白水解酶相互作用等实现的。MMP-9是基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）成员之一，能够降解细胞外基质，肿瘤的侵袭和转移过程中起着重要的作用。本文对Annexin A2和MMP-9在胃癌组织中的表达进行研究，并分析二者在胃癌组织中表达是否具有相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集延安大学附属医院病理科2011年至2012年63胃癌术后蜡块标本，从中选取20例癌旁正常组织（距胃癌组织大于5cm）。全部病例均经手术和常规病理证实，术前未行任何化疗、放疗。其中男性49例，女性14例，年龄34岁到81岁，平均年龄60.6岁。病理类型： 高中分化腺癌30例，低分化腺癌33例；无淋巴结转移者26例，有淋巴结转移者37例；TNM分期Ⅰ期及Ⅱ期共30例，Ⅲ期及Ⅳ期共33例；每个病理资料完整，每个病理蜡块取切片4-6张，分别作预实验及免疫组化染色之用，制成连续切片，便于实验过程中作对比。

1.2 实验试剂 兔抗人annexinA2单克隆抗体、兔抗人MMP-9单克隆抗体均为即用型，均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色及结果判断 免疫组化采用SP法，每个病例切片分为二部分，分别检测annexinA2 和MMP-9蛋白在胃癌组织中的表达。annexinA2 和MMP-9

阳性染色均位于细胞浆和（或）细胞膜上，呈棕黄色，显色强时为棕褐色。在光镜下用高倍镜视野对每例组织切片癌组织区域连续计数500个细胞，计算癌细胞所占的阳性比例。组织中胞浆为黄色或棕黄色为阳性，将阳性细胞染色数量分3级：弱阳性，阳性细胞数< 10 % ，显色强度淡黄色（1分）；强阳性，阳性细胞数> 65 % ，细胞呈黄色或棕黄色（3分）；中等阳性，阳性细胞数及显色强度界于弱阳性和强阳性之间（2分）；无阳性，阳性细胞数无（0分）。阳性细胞数得分与染色强度得分相加，≥5分为阳性（+），<3 分为阴性（-）。显色强度与背景色无差异者为阴性。结果由3个以上病理研究者进行阅片，结果不统一者，进行重新阅片，以多数观察者的结果为标准。

1.4 统计学分析

应用SPSS 1 7.0软件包进行统计分析，annexinA2 和MMP-9与胃癌各临床病理相关因素之间的差异性比较采用X2检验，Spearman等级相关分析用于各指标间相关性研究。α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 annexinA2、MMP-9在胃癌和正常胃粘膜组织中的表达

胃癌组织中的annexinA2、MMP-9阳性表达率分别为90.5%（57/63）和93.7%（59/63），正常胃黏膜annexinA2、MMP-9阳性表达率分别为35.0%（7/20）和25.0%（5/20），经X2检验，差异均有统计学意义（P<0.01）。

2.2 annexinA2、MMP-9表达与胃癌组织临床病理特征关系

经X2检验：annexinA2、MMP-9在胃癌组织中的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期具有相关性（P<0.05），而二者与患者性别、年龄均无相关性（P>0.05）。

2.3胃癌组织中annexinA2表达与MMP-9表达的相关性

胃癌组织中57例annexinA2表达阳性者，其MMP-9表达阳性53例，表达阴性4例；6例annexinA2表达阴性者，其MMP-9表达阳性4例，表达阴性2例。经Spearman等级相关分析，annexinA2和MMP-9在胃癌组织表达具有相关性，切呈正相关性（r=0.263 ，P<0.05）。

3 讨论

恶性肿瘤的主要生物学特性是浸润和转移这也是恶性肿瘤患者的主要死因。人们对肿瘤浸润和转移的机制进行了广泛的研究，并发现细胞外基质在肿瘤的浸润和转移过程中起着重要的作用。细胞外基质是由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质，构成复杂的网架，连接组织结构、调节组织的发育和细胞生理活动，是阻碍肿瘤浸润转移的天然屏障，肿瘤浸润转移初期，肿瘤细胞能够分解细胞外基质从中通过。细胞外基质包括胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、TN-C及其他多种蛋白比如基质金属蛋白酶及其抑制剂等，有研究表明AnnexinA2是TN-C的受体，它们和基质金属蛋白酶共同作用于细胞间质，促进肿瘤的侵袭和转移。

膜联蛋白（Annexin，ANX）是一个Ca2+依赖的磷脂结合蛋白家族，物种间膜联蛋白高度保守，脊椎动物细胞中膜联蛋白被定义为膜联蛋白A家族，其家族在人类存在12个成员，主要有A1--A11和A13，而膜联蛋白A2又称膜联蛋白Ⅱ、ANXⅡ、LPc2P36、LipoeortinⅠ和CalpactionⅠ重链[1-2]。AnnexinA2可分布于细胞的胞核、胞浆及细胞的表面，胞外的AnnexinA2是组织型纤溶酶原激活物、纤溶酶原及细胞黏合素C的受体，这些蛋白酶及其底物均与肿瘤的发展及转移关系密切。研究证实在肿瘤细胞表面已有组织蛋白酶B与AnnexinA2四聚体相互作用，由此推测：通过AnnexinA2使以上多种蛋白酶及其底物在肿瘤细胞表面共区域化，可能促进：激活蛋白酶前体启动蛋白水解级联反应；选择性降解细胞外基质蛋白，从而导致肿瘤细胞从原发肿瘤灶脱离并迁移、侵犯局部组织。AnnexinA2是纤溶酶原和组织性纤维蛋白酶原激活剂（tPA）的受体，可以促进纤溶酶的产生并激活其蛋白水解功能，产生纤溶酶，而已知过量的纤溶酶能降解血管壁细胞外基质和基底膜。在肿瘤血管生成和浸润转移中也有重要作用。因此，AnnexinA2作为蛋白酶和细胞外基质蛋白的受体能够激活蛋白酶并启动蛋白水解级联反应，选择降解细胞外基质蛋白和基底膜，从而导致肿瘤细胞的粘附、浸润和转移[3-4]。

MM -9是基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）成员之一，也是MMPs中分子量最大的酶，与MMPs的其他成员一样，其也是具有锌脂结构的钙依赖性蛋白水解酶，能够降解细胞外基质（ECM）中的Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和明胶，在上皮或内皮细胞的基底膜部，ECM以基底膜的形式存在，因此，MM-9能够通过破坏基底膜的完整性，在肿瘤的发生发展和侵袭转移中起着重要的作用。研究发现，MM -9具有调节细胞粘附力的功能，帮助癌细胞完成对ECM的粘附、脱离和迁移[5]。肿瘤的发生发展有赖于肿瘤新生血管的生成，MM -9通过降解基底膜和细胞外基质有促进血管内皮迁移和血管塑形，促进肿瘤新生血管的生成[6]。也有人认为MM -9参与肿瘤血管的生成可能是通过血管内皮生长因子（VEGF）改变内皮细胞的活化形式，增强MMP-9的释放，加快基底膜的降解和内皮细胞的迁移来促进肿瘤血管的生成[7]。近年来，国内外学者在许多肿瘤组织中都发现MMP-9高表达，并发现其表达程度与肿瘤的侵袭性有关[8-11]。

本实验采用免疫组化SP方法检测63例胃癌组织和20例正常胃黏膜组织中AnnexinA2 和MMP-9的表达。结果显示，AnnexinA2 和MMP-9在胃癌组织中的阳性表达率为90.5%、93.7%，高于正常胃黏膜组织中的表达率35%、25%，两组之间比较差异具有统计学意义（P<0.01）。annexinA2在胃癌组织中的阳性表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期具有相关性（P<0.05），王勇[12]等研究发现，AnnexinA2不但在胃癌中呈高表达，且与胃癌分期、浸润深度等病理学特征也有良好的相关性，越是晚期胃癌，表达越高，这与本实验结果一直。MMP-9的表达与胃癌临床病理参数之间的关系，结果显示，淋巴结转移组明显高于未发生淋巴转移组（P<0.01），这与Kabashima[13]等研究结论相同。同时发现MMP-9在胃癌中的表达与其分化程度、浸润深度及TNM分期密切相关（P<0.05），由此推测，MMP-9在胃癌的浸润和转移过程中有着重要的意义。结果显示，二者在胃癌中的表达与肿瘤的浸润和转移具有相关性。这提示联合检测二者在胃癌中的表达，可能为胃癌的诊断及预后提供新的依据，但具体机制还有待进一步研究。

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