辣椒细菌性叶斑病病原鉴定及室内药剂筛选

摘要

2012-2015年，在海南省辣椒主产区发生了一种严重危害辣椒的叶斑病，从发病叶片中分离到一种细菌，通过致病性测定、柯赫氏法则验证及分子生物学鉴定，将引起该病害的病原鉴定为野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）。选用8种杀菌剂通过平板对峙法对该病原进行了室内毒力测定，结果表明：其中6种药剂对该病原有抑菌效果，效果最好的为72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂，47%春雷·王铜可湿性粉剂次之，2%春雷霉素水剂和20%噻菌铜悬浮剂没有抑菌效果，不同药剂之间或同一种药剂不同剂型之间抑菌效果差异较大。病原鉴定和药剂筛选可为该病害的诊断和防治提供科学依据。

关键词

辣椒细菌性叶斑病； 病原菌； 杀菌剂； 药剂筛选

海南是我国冬季北运蔬菜的重要生产基地，辣椒的种植面积达2万hm2左右。2012年开始，在海南省海口、澄迈、文昌、琼海等市县普遍发生了一种细菌性叶斑病，该病害在辣椒苗期到成株期均可发生，其症状与已报道的辣椒细菌性斑点病症状相似[1]。病原菌主要危害叶片，发病初期叶片上出现黄绿色小斑点，逐渐发展扩大后病斑边缘暗褐色，中央稍凹陷，湿度较大时，相互连接形成不规则大型斑。发病严重时叶片大量脱落，落花、落果甚至猝倒，成片死亡。病原菌一旦侵染成功，便可迅速扩展，给农户造成巨大经济损失。2015年初在海南省灵山镇调查发现，田间辣椒发病率平均达80%，至少造成30%的减产。为明确其病原，本研究对该病害的病原进行了组织分离、致病性测定及分子生物学鉴定。同时，本文选取了8种主要杀菌剂进行了抑菌试验，以期筛选出较好的杀菌剂，为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离及鉴定

1.1.1 病原菌分离

2014年3月，在海南省灵山镇采集到辣椒细菌性叶斑病病株。将病健交界处叶片组织剪成0.3 cm×0.3 cm左右的方块，用75%乙醇表面消毒2 min，无菌水冲洗3次，放入点滴板内加入50 μL无菌水研磨，用移液枪吸取20 μL研磨液于LB平板（胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g、琼脂 17 g，加水定容至1 000 mL，调至pH 7.0，121℃灭菌20 min）上，采用接种环进行画线，28℃倒置培养48 h，挑取单菌落进行纯化培养。

1.1.2 柯赫氏法则验证

在采集病株的同时，将健康植株连根拔起带回实验室栽种，用于回接试验。将分离纯化的菌株接种到液体LB培养基中，置于摇床中28℃、180 r/min培养至对数期，细菌浓度达到108 cfu/mL左右时用喷雾法接种辣椒，3次重复，无菌水做对照。接种株置于自然条件下培养，日平均气温28℃左右，每天进行喷雾保湿，观察发病情况，对发病叶片进行病原菌的再分离。

1.1.3 分子鉴定

将病原菌培养至对数期，提取其基因组DNA，采用通用引物27F/1492R[2]（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′/5′TACGGYTACCTTGTTACGACTT3′）和L1/L2（5′AGTCGTAACAACGTAGCCGT3′/5′GTGCCAAGGCATCCACC3′）进行扩增，扩增产物回收纯化后进行平端化反应，连接到含有致死基因的pLB vector上并转化大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α菌株。在含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB平板上直接挑取阳性克隆，送至华大基因公司进行测序。试验所用的试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

1.2 8种杀菌剂对病原的抑菌试验

8种杀菌剂包括46%氢氧化铜干悬浮剂和53.8%氢氧化铜水分散粒剂（美国杜邦公司），72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂（华北制药河北华诺有限公司），47%春雷·王铜可湿性粉剂和2%春雷霉素水剂（日本北兴化学工业株式会社），2%春雷霉素可湿性粉剂（海利尔药业集团股份有限公司），30%壬菌铜微乳剂（西安近代科技实业有限公司），20%噻菌铜悬浮剂（浙江龙湾化工有限公司）。

按照8种药剂的使用说明书及预备试验测试结果，将每种药剂稀释成5个浓度梯度（表1）。取5 mL培养至对数期的病原菌加入到200 mL 45℃左右液化的LB固体培养基中，混匀后倒平板（皿直径为9 cm），平板晾干后，用直径为4 mm的灭菌打孔器在平板上打出呈等边三角形的3个孔，吹干孔内水分[3]。取各个不同浓度的药剂加入到LB培养基孔中，每个浓度重复3次，无菌水做对照，28℃恒温培养72 h后十字交叉法测量抑菌圈直径[4]，计算不同浓度的药剂产生的抑菌圈平均值。

1.3 抑菌数据处理

根据抑菌圈直径计算相对抑菌率，相对抑菌率（%）=（处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径）/处理抑菌圈直径×100。以药剂有效成分浓度对数值为自变量（x），相对抑菌率的几率值为因变量（y）， 建立毒力回归方程，计算决定系数R2和EC50。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离及鉴定

常规组织分离法得到的辣椒细菌性叶斑病菌菌落形态见图1。利用喷雾法回接，7 d后发病情况如图2所示，约25 d后叶片全部脱落。接种辣椒表现症状与初次分离时的症状一致。分子鉴定结果表明，采用27F /1492R引物扩增后得到1 505 bp大小的片段，登录NCBI网站进行BLAST，发现该片段与菌株Xanthomonas fuscans subsp. fuscans（GenBank： FO681494.1）、Xanthomonas axonopodis pv. citrumelo（GenBank： CP002914.1）和Xanthomonas campestris pv. vesicatoria （GenBank： AM03995 2.1）的16S rRNA相似性均为100%，与Xanthomonas citri subsp. citri （GenBank： CP008989.1）的16S rRNA相似性为99%。采用L1/L2引物扩增后得到578 bp大小的片段，通过比对后发现，该片段与Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 的ITS区相似性为99.83%，与Xanthomonas fuscans subsp. fuscans ITS序列的相似性为98.97%。通过2对引物的对比，最终将该菌株鉴定为野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria，XCV）。

2.2 8种杀菌剂抑菌结果及分析

根据抑菌圈直径平均值，建立8种药剂的毒力回归方程，从表1可以看出，8种药剂中，2%春雷霉素水剂和20%噻菌铜悬浮剂基本没有抑菌效果，其他6种药剂均有一定的抑菌效果，但不同药剂之间或同一种药剂不同剂型之间差异较大。其中72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂和47%春雷·王铜可湿性粉剂EC50较低，分别为406.44 mg/L和597.04 mg/L，抑菌效果较好。46%氢氧化铜干悬浮剂、53.8%氢氧化铜水分散粒剂和2%春雷霉素可湿性粉剂EC50分别为1 083.93 mg/L、1 462.18 mg/L和1 660.73 mg/L，抑菌效果一般。30%壬菌铜微乳剂EC50为2 004.47 mg/L，抑菌效果较差。2%春雷霉素的不同剂型抑菌效果差异较大。

3 结论与讨论

本研究结果表明，分离自灵山镇的辣椒细菌性叶斑病病原为野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种，与辣椒细菌性斑点病为同一种病原，最早由Young等[5]命名。据报道，该病原主要侵染辣椒和番茄[67]，也可侵染曼陀罗、枸杞、马铃薯等，可种子带菌，也可随病残体在土壤中越冬[8]，在我国北京、内蒙古、新疆、云南[9] 、湖南、陕西[10]等地区普遍发生。辣椒细菌性斑点病病原在分类上比较复杂，由于16S rDNA的高度保守性，无法区分近缘种，因此研究近缘种的生物学特性及差异基因尤为重要。多年来陆续报道了该菌的多种分类方法，根据病原菌是否具有解淀粉和果胶活性，将其分为A和B组，A组菌没有水解淀粉和果胶活性，B组菌可以水解淀粉和果胶[11]。根据病原菌对碳基质的利用、酶活性及脉冲场凝胶电泳多态性，又添加了C组和D组菌株[12]，2004年，Jones等[13]将A、B、C、D 4个表型组依次重新命名为4个种：X.euvesicatoria、X.vesicatoria、X.perforans和X.gardneri。陈新[10]等通过REAPCR的方法研究发现这4种表型在国内均存在。

8种杀菌剂室内抑菌结果显示：72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂抑菌效果最好，目前仍是防治辣椒细菌性叶斑病的首选药剂，47%春雷·王铜可湿性粉剂次之，而2%春雷霉素水剂和20%噻菌铜悬浮剂没有抑菌效果。2%春雷霉素两种剂型的抑菌效果差异较大，可湿性粉剂比水剂效果好。虽然72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂的防效最好，但国内外也均报道了对该药剂产生抗药性的菌株[1415]。病原菌对药剂的抗性问题已成为田间防治病害的主要问题，因此要定期检测田间病原对杀菌剂的抗药性，及时更换有效药剂，延缓抗药性的产生。

参考文献

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（责任编辑：杨明丽）

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