新疆维吾尔族局部晚期或晚期食管癌放化疗疗效相关蛋白及KEGG通路的分析

【摘 要】目的：分析维吾尔族局部晚期或晚期食管癌患者的血清差异蛋白相关通路。方法：收集维吾尔族食管鳞癌患者28例，采集维吾尔族食管癌患者接受放化疗前后的静脉血，对食管癌与健康对照组进行差异蛋白筛选并导入KEGG数据库，进行进一步分析。结果：放化疗后近期疗效无效组与近期疗效有效组比对，共筛选出52个差异蛋白；放化疗后PFS大于1年组与小于1年组比对，共筛选出128个差异蛋白；近期疗效行KEGG通路分析中，共筛选出4个有统计学差异通路；远期疗效PFS大于1年组与PFS小于1年组比对差异蛋白导入KEGG数据库，有统计学差异的KEGG通路有1个。结论：在KEGG通路分析中，维吾尔族食管癌患者在治疗前后均观察到，KEGG通路TLR、NF-kB信号通路有相似的差异蛋白参与，均提示预后不良，可以作为今后研究重点。

【关键词】食管癌；民族；蛋白；信号通路

【中图分类号】R735.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）08--01

新疆部分高发肿瘤疾病呈现地域性分布，如南疆范围内以宫颈癌为主，北疆范围内以食管癌为主。维吾尔族是新疆主要的少数名族，人口约占全区的一半以上。且王振家等[1]报道在哈密地区维吾尔族恶性肿瘤分布中，食管癌排在了第1位，而且维吾尔族恶性肿瘤的总发病率高于汉族、哈萨克族。在人体血液循环中有大量的小分子量（low molecular weight，LMW）蛋白。这些小分子量蛋白蕴含的信息能用于早期诊断、鉴别诊断、疗效评估和预后判断[2]。肿瘤患者的体液中如血清或血浆就是可靠的标记物来源[3]。理想的蛋白标记物应具有很高的特异性和敏感性，所应用的技术可靠、快速和经济；标本中含有的标记物容易获得。因此，我们将对维吾尔族局部晚期食管癌患者的疗效相关的血清差异蛋白进行筛选并进一步行KEGG通路分析，试图发现具有预测放化疗疗效价值的分子标记物。

1 材料与方法

1.1 材料收集

收集新疆醫科大学第一附属医院2014年06月-2015年06月收治的临床分期为III-IVA期的维吾尔族食管鳞癌患者28例。采集接受放化疗前食管鳞癌患者外周静脉血5ml，所有食管癌患者完成同期放化疗后，按照随访时间长短再次采集静脉血5ml。所有病例均经胃镜活检，组织病理确诊为鳞状细胞癌，分期为III-IVA期食管癌患者，一般状况（PS）评分≤2分。所有患者预计生存期≥6个月，无主要器官功能障碍，心、肺、肝、肾功能基本正常。

同期放化疗方案：化疗方案：FP方案：5-FU （氟尿嘧啶）（750-1000mg/m2）+DDP（顺铂）（75-100mg/m2），3-4周一次。所有的患者先行同步放化疗，放疗结束后然再序贯化疗，直至完成共4-6周期化疗。如近期疗效评价为有效，继续原化疗方案。如评价为无效，则改用TP方案：紫杉醇（135-150mg /m2） /多西他赛（75mg/m2） +卡铂（AUC5-6） /顺铂（75mg/m2）。放疗方案：三维适形放疗或调强放疗，DT50-60Gy/2Gy /25-30f。

1.2 方法

采用同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ），该技术通过蛋白质提取、消化，利用多种同位素试剂标记蛋白多肽，然后用高精度质谱仪串联分析，筛选综合治疗前后食管癌患者血清蛋白质谱表达差异。将差异蛋白导入KEGG的Pathway数据库，分析差异表达蛋白质的相关的代谢通路。

1.3 血清差异蛋白的筛选标准

按对比要求进行组间比较，组间比值大于1.2（表达上调）或小于0.833（表达下调），P<0.05为差异蛋白的筛选标准。其中组间比值大于1.5为显著表达上调，组间比值小于0.6为显著表达下调，对筛选的差异蛋白进一步在http：//www.uniprot.org进行验证。

2 结果

2.1 放化疗后食管癌患者近期疗效差异蛋白筛选

对完成放化疗后的患者进行随访评价，结果显示：近期疗效有效的食管癌患者有15人，其中完全缓解的有1人，部分缓解的有14人；近期疗效无效的食管癌患者有13人，其中稳定的有8人，进展的有5人，客观有效率为53.6%。共筛选出52个差异蛋白，上调蛋白有29个，下调蛋白有23个，其中显著表达上调的蛋白有角蛋白10（K10）、角蛋白2（K2）等，显著表达下调的蛋白有组蛋白H4（H4）、组蛋白H2B等。

2.2 放化疗后食管癌患者PFS大于1年与小于1年差异蛋白筛选

PFS大于1年组的食管癌患者有16人，PFS小于1年组的食管癌患者有12人，其中有5人在1年内死亡，7人在1年内进展。共筛选出128个差异蛋白，上调蛋白有73个，下调蛋白有55个。其中显著表达上调的蛋白有cDNA FLJ93312（B2R773）、REV25-2（A0N7J6）等，显著表达下调的蛋白有免疫球蛋白重链可变区1-18（IGHV1-18）等

2.3 近期疗效血清差异蛋白相关通路分析

52个局部晚期或晚期维吾尔族食管鳞癌放化疗后近期疗效组的差异蛋白被导入KEGG数据库后，将不同的蛋白质富集到共同代谢途径中，共得到104个差异蛋白的KEGG通路，有统计学差异的KEGG通路有4个（P<0.05），没有与肿瘤有相关性的通路（表1）。

2.4 局部晚期或晚期维吾尔族食管鳞癌患者PFS大于1年组与PFS小于1年组比对差异血清蛋白相关通路分析

128个局部晚期或晚期维吾尔族食管鳞癌放化疗后远期疗效PFS大于1年组与PFS小于1年组比对差异蛋白被导入KEGG数据库后，将不同的蛋白质富集到共同代谢途径中，共得到127个差异蛋白的KEGG通路，有统计学差异的KEGG通路有1个（P<0.05），与肿瘤有相关性的通路有1个（表2）。

3 討论

由于食管癌缺乏特异性的分子通路机制的结果，使得个体化治疗仍处于盲区。若能在治疗前根据食管癌患者分子蛋白情况，预知化疗方案的敏感度，精准制定符合患者个体差异的有效方案，就可使患者获得收益大而毒副作用小的的效果。本研究通过采用iTRAQ最新蛋白定量技术，收集了维吾尔族食管鳞癌患者28例，通过治疗后近期疗效好坏、PFS生存时间长短进行分组对比，并将显著差异蛋白导入KRGG数据库进行通路分析，试述如下：

局部晚期或晚期维吾尔族食管鳞癌近期疗效行KEGG通路分析中，将52个差异蛋白导入KEGG数据库，共得到104个差异蛋白的KEGG通路，我们选择P<0.05有统计学差异的信号通路，共筛选出4个，却无肿瘤相关通路。发现近期疗效中组蛋白H2B下调参与TLR通路（P=0.28），而该通路的激活直接影响肿瘤微环境，促进肿瘤生长，这与近期疗效无效提供一个很好的解释，进一步验证了此通路有促进癌症发展的结论，可作为今后研究的重点。

我们同样将128个远期疗效PFS大于1年组与PFS小于1年组比对差异蛋白导入KEGG数据库，将不同的蛋白质富集到共同代谢途径中，共得到127个差异蛋白的KEGG通路，有统计学差异的KEGG通路有1个（P<0.05），PPAR信号通路为肿瘤相关通路。

过氧化物酶体增殖物激活型受体（peroxisome proliferator activated-receptors，PPARs）是一类由配体激活的核转录因子，属于受体超家族成员。曾有学者[4]已经证实胰腺癌中PPARα水平明显高于肿瘤临近组织，PPARα表达水平与肿瘤患者高的生存率呈负相关。而Wu K[5]在食管癌方面的研究中发现，PPARg的激活抑制了tlr4依赖性MAPK通路，抑制了食管癌细胞的增殖并且诱导食管癌肿瘤细胞凋亡，本部分研究中PFS>1年组与PFS<1年组的差异蛋白载脂蛋白（a、A-II、A-I、C-III、A-IV）、cDNA，FLJ93312参与该通路的调控，与Wu K既往研究一致，促进了食管癌的凋亡，有较好的预后。虽然在治疗前后均有此通路参与，但P>0.05，考虑经过一段时间放化疗，PPAR信号通路进一步激活起到抑制肿瘤作用，使患者获得比较长的生存时间。

除此之外，信号通路NF-kB在此疗效对比中同样有差异蛋白脂多糖、cDNA FLJ75416参与，活化的NF-kB转位到核内与其相关的DNA基序结合可以诱导靶基因的转录。包括多种病原的组分例如脂多糖，前炎性细胞因子等在内的多种信号可活化这种途径。脂多糖与肿瘤促进有一定相关，此蛋白下调是否可下调NF-kB通路的表达，使患者有较好的预后，我们需要进一步沉默或激活靶基因进行证实。

通过KEGG通路分析差异蛋白参与的信号通路，进一步验证了差异表达的血清蛋白的功能，为今后差异蛋白的靶基因的研究奠定了基础。由于食管癌分子蛋白可以参加数百种通路，且通路之间影响也有相互交叉，且无统计学差异的通路也并非真正意义上无效果的通路，故特异性通路需要更多的有质量的实验来探索及验证。

总而言之，此部分内容分别分析了维吾尔族近期疗效、远期疗效相关的差异显著蛋白相关的信号通路。在KEGG通路分析中，维吾尔族食管癌患者在治疗前后均观察到，KEGG通路TLR、NF-kB信号通路有相似的差异蛋白参与，均提示预后不良，可以作为今后研究重点。

参考文献

王振家， 李霞， 高凡， 等.新疆哈密地区2010～2012年恶性肿瘤发病分析[J].新疆医学，2015，45（10）：1501-1504.

Blanchard P， Quero L， Pacault V.Prognostic significance of anti-p53and anti-KRas circulating antibodies in esophageal cancer patients treated with chemoradiotherapy[J].2012，12（119），1471-2407.

Liotta LA， Ferrari M， Petricoin E.Clinical proteomics：written in blood[J].Nature ，2003，425，905-909.

Xue J， Zhu W， Song J， et al.Activation of PPARα by clofibrate sensitizes pancreatic cancer cells to radiation through the Wnt/β-catenin pathway[J].Oncogene.2017Oct23.

Wu K， Yang Y， Liu D， et al.Activation of PPARγ suppresses proliferation and induces apoptosis of esophageal cancer cells by inhibiting TLR4-dependent MAPK pathway[J].Oncotarget.2016Jul12；7（28）：44572-44582.

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