淡竹叶红外光谱的多级鉴定与分析

材料

1.1仪器设备和数据处理软件

IR100型傅里叶变换红外光谱仪（Therom Nicolet， USA），其光谱范围为4 000～400 cm^{-1，分辨率为4 cm-1，扫描累加次数为16次；扫描时消除H2O和CO2的干扰；WS 70-1型红外线快速干燥器（上海市吴淞五金厂）；YS-2型压片机（上海山岳科学仪器公司）；玛瑙研钵。}

红外一维图谱由Encompass红外数据采集分析软件获得，谱图由OMNIC 8.0软件分析获得。二维相关图谱2Dshige version 1.3由 Shigeaki Morita （Kwansei-Gakuin University， 2004-2005）分析获得。聚类分析结果由PASW Statistics 18.0.0 （Polar Engineering and Consulting， 1993-2007）软件计算获得。

1.2样品来源及试剂

淡竹叶样品信息见表1，经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为禾本科淡竹叶L. gracile，鸭跖草药材经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为鸭跖草科植物鸭跖草Commelina communis Linn.的干燥地上部分。溴化钾（SP，国药集团试剂有限公司，批号51019561）。

2方法

2.1供试品的制备

取干燥的淡竹叶原药材，除去杂质，粉碎过200目筛。伪品鸭跖草供试品制备方法同上。

2.2供试品的测定

采用KBr压片法。取适量KBr 于红外干燥箱中干燥3 h，取约100 mg KBr于玛瑙研钵中在红外灯下研匀，并除去水分。将KBr倒入模具中，抽真空压片，加压10 mPa，制成透明薄片，置红外分光光度计上于4 000～400 cm^{-1扫描空白片。取样品粉末约1～100 mg KBr中，在红外灯下研匀，自“倒入模具中”起操作，每个样品累积扫描16次。在室温下获得各样品的一维红外谱图，谱图用OMNIC 8.0软件进行分析。}

2.3方法学考察

2.3.1 稳定性试验 取淡竹叶样品S3按2.2 项下方法，压片后置干燥器中，每0，1，2，3，4，5 h测定一次，所得红外光谱图基本一致，谱间相关系数分别为1.000 0，0.999 9，0.999 8，0.999 7，0.999 7，RSD为0.13%。结果表明样品在5 h之内基本稳定。

2.3.2 精密度试验 取淡竹叶样品S3按2.2 项下方法，压片后连续重复扫描5次，所得红外光谱图一致，进行相似度比较，相关系数分别为1.000 0，1.000 0，1.000 0，0.999 9，1.000 0，结果表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取淡竹叶样品S3按2.2 项下方法，重复压片5次，分别进行扫描测定，所得图谱进行相似度比较，相关系数分别为1.000 0，0.999 8，0.999 5，0.999 7，0.999 3，RSD为0.27%。结果表明该方法具有良好的重复性。

3结果与讨论

3.1淡竹叶及其伪品鸭跖草的红外光谱分析

3.1.1 淡竹叶及其伪品鸭跖草的一维红外光谱分析（一级鉴定） 淡竹叶原药材样品及其伪品鸭跖草的一维光谱图，见图1。可见淡竹叶药材在其波数为3 431，2 922，2 025，1 656，1 380，1 039，533，407 cm^{-1等处均有吸收，分析判定，淡竹叶药材的主要吸收峰包括：波数为3 431 cm-1及其附近区域的υOH宽强吸收和υφH（υCH），2 922 cm-1及其附近区域的υC-H（伸缩振动），1 656，1 547 cm-1及其附近区域的υCC（骨架振动），1 380 cm-1及其附近区域的δC-H（弯曲振动），1 039 cm-1及其附近区域的υC-O。可见体系中含有较强的芳烃体系，可能存在有由于羟基被糖基取代而形成的孤立体系，也可能存在共轭体系，推测有黄酮类或萜类结构；1 039 cm-1有强吸收的糖峰位置推测可能是多糖或取代糖苷。通过对淡竹叶和鸭跖草的图谱进行归一化处理，见图1，能更明显的看出鸭跖草的3 383，1 646，1 322，1 054，780 cm-1波数峰明显强于淡竹叶。}

3.2淡竹叶及其伪品鸭跖草的二维相关红外光谱分析（三级鉴定）

淡竹叶和鸭跖草的一维红外光谱和高分辨的二阶导数谱都从不同的角度上体现了两者的差异，为了鉴定的可靠和准确，进一步观察两者二维相关红外结构特征。

淡竹叶和鸭跖草在1 800～1 000 cm^{-1的二维相关红外光谱见图3。可以清楚地看到淡竹叶在1 200～1 100 cm-1形成一个2×2的峰簇，该峰簇是由对角线上的1 125，1 175 cm-1彼此相关形成的，但鸭跖草在该区域内无相关峰簇的形成，而在1 220 cm-1波数形成一个峰簇。在1 000～450 cm-1区域内，鸭跖草有一个3×3的峰簇，该峰簇是由对角线上的880，780，500 cm-1彼此相关形成的，而淡竹叶没有这些峰簇，见图4。}

3.3不同批次淡竹叶的比较

测定所有淡竹叶样品的红外光谱图，见图5，从光谱图上可以看出，不同淡竹叶样品整体红外光谱图的峰形、峰位、相对峰高基本相同，对其进行二阶导数谱分析，可见在1 800～650 cm^{-1，红外光谱图差异较为明显，见图6，7，分别在1 670～1 650，1 560～1 500，860，660 cm-1波数位置，不同批次淡竹叶的峰形和峰高有一定的差异。各批次药材IR主要吸收峰峰位表及峰信号归属见表2。可见不同产地淡竹叶在类黄酮物质的羟基取代位置、数量，取代糖的结构、数量有所差异，从而使黄酮类物质的数目和数量有所差异。在此基础上，本实验进一步探讨采用共有峰和变异峰率的计算方法，结合主成分分析法，对不同产地淡竹叶进行比较。}

可以从共性和差异2个方面全面刻画2个指纹图谱，共有峰率越高，说明2个指纹图谱的共性越大。在变异峰率指标中，由每个指纹图谱中的变异峰数与共有峰数的比值，便可以很好地衡量指纹图谱的变异情况。2个指纹图谱的变异峰率差异越大，说明2种药材的差异越大，反之，变异峰率都小，说明2种药材品种或某种性质相近，变异就小。

双指标序列：以各样品为参考，用指纹图谱共有峰率和变异峰率计算公式分别计算其他样品的红外指纹图谱的共有峰率和变异峰率，并且按照共有峰率的大小将它们排成一个序列（包含共有峰率和变异峰率值）。该序列称为共有峰率和变异峰率双指标序列，其表示方式为“a：b（P；Pva，Pvb）”。n个样品可得到n个不同的序列，因此，可以构成n维序列空间。

通过该序列可以精确判断任一样品与其他样品的区别。本实验中，以11个样品为参照点建立的11个共有峰率和变异峰率双指标序列，形成11维序列空间，便可以在2+n维（n=样品数）空间中考察各个样品的异同，从而具有很强的鉴别力。

共性鉴别指标：①共有峰率P=（共有峰数Ng/2幅红外图中的独立峰数Nd）×100%。②共有峰数Ng：指在比较的2幅红外图中都出现的吸收峰的个数。③独立峰：红外指纹图谱中不同的吸收峰。

变异鉴别指标：①变异峰率Pv：指该红外图中相对于共有峰的变异峰数与其共有峰数的比值。②Pva =（na/Ng）×100%，Pva为指纹图谱a的变异峰率。③Pvb =（nb/Ng）×100%，Pvb为指纹图谱b的变异峰率。na为指纹图谱a中相对于其共有峰的非共有峰数，称为a的变异峰数。nb为指纹图谱b中相对于其共有峰的非共有峰数，称为b的变异峰数。

11个产地批次淡竹叶药材的双指标序列以S1为例。

S1：S2S4（77.27；17.65，11.76），S5S9（76.19；25.00，6.25），S3（72.73；25.00，12.50），S11（70.83；17.65，23.53），S10（59.09；53.85，15.38），S6S7（56.52；53.85，23.08），S8（52.17；66.67，25.00）

所得序列结果以共有峰率为75%为限，可将11个批次的淡竹叶归为4组，分别为：第一组S1S2S3S4；第二组S5S9；第三组S6S7S8S10；第四组S11。

S1～S4样品分别采自江苏镇江、宜兴，浙江磐安和安徽宣城，三省接壤，均属于长江三角洲地区，地域环境和气候条件较为接近，样品相似度较高。S5和S9分别产于福建尤溪县和广西荔浦县，基本处于相似的纬度带，气候相近，山地植被环境等亦较为相似，因此样品相似度为各组中最高。S6和S7分别产自江西宜春和湖南邵阳两地，均为现有淡竹叶主产区，分组结果可见目前市场上流通的淡竹叶相似度较高。S11为唯一的高海拔地区样品，气候因子等明显区别与其他样品，样品单独分为一组，可见其与其他样品均存在差异性。自然环境作为影响中药品质的重要因素之一，从遗传基因水平和生态环境层面影响着道地药材的形成。此处讨论仅从环境区划角度分析各产地淡竹叶，旨在寻找快速鉴别药材产地的平台和方法，亟待对其遗传背景、植物内生菌、土壤微生物以及采收加工等影响因素做进一步探讨。

3.3.2 淡竹叶红外图谱聚类分析 采用系统聚类分析法，选取平方Euclidean距离作为度量标准，对淡竹叶药材粉末FTIR图谱数据进行聚类分析，见图8。

以距离5划分，11个淡竹叶样品分别归为4类，S1，S2，S3和S4归为一类，S5和S9为一类，S6，S7，S8和S10为一类，S11独立为一类。

与共有峰率和变异峰率双指标序列分析方法结果相比较，2种方法的结果趋势一致，即分组结果相同。但通过聚类分析的距离标准，可清晰看出各组间的相似度差异，这一点双指标序列分析无法直观体现。

分析方法不同，其分析的依据和参数均有所差异，从不同的角度出发，采用不同的分析方法，得到相同或相近的分析结果，表明这2种方法在分析此类问题上，较为可靠，可用于快速分析和区别不同来源与产地的中药材。

4结论

本实验对淡竹叶药材及其常见伪品鸭跖草进行了比较，结果表明采用红外指纹图谱、二阶导数图谱和二维相关图谱相结合的方式，可以准确判别淡竹叶药材和其常见伪品。本实验克服了利用高效液相色谱法建立指纹图谱时，药材提取等前处理过程复杂、成分提取不完全、药材用量大、色谱分离难度大等问题。红外光谱法药材用量少、操作简便、检测时间短、重现性好，结合双指标序列分析法的n维序列空间和聚类分析，结果稳定可靠。本实验为淡竹叶及其他中药材的快速鉴别提供了新的科学依据和思路，为后续探讨和完善红外光谱在中药真伪鉴别和产地鉴别等方面的应用，提供了一定的科学依据和参考。

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Multi-level identification and analysis about infrared

spectroscopy of Lophatheri Herba

SHAO Ying， WU Qi-nan*， GU Wei， YUE Wei， WU Da-wei， FAN Xiu-he

（Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization of Jiangsu Province，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

[Abstract] Based on the infrared spectra of Lophatheri Herba and Commelinae Herba， one-dimensional infrared spectra， second derivative spectra and two-dimensional correlated spectra were used to find out the differences between Lophatheri Herba and its imitations， respectively. The common peak ratio and variant peak ratio dual-indexes sequential were calculated and established according to infrared spectra of eleven batches of herbs. Infrared spectral data of Lophatheri Herba cluster analysis was applied to explore the similarity between each sample. The grouping results trend of sequential analysis of dual-indexes and cluster analysis was accordant. The results showed that the differences could be found by multi-level identification， and the source and the quality of the herbs could be effectively distinguished by the two analysis methods. Infrared spectroscopy， used in the present work exhibited some advantages on quick procedures， less sample required， and reliable results， which could provide a new method for the identification of traditional Chinese medicine with the imitations and adulterants， and the control of quality and origin.

[Key words] Lophatheri Herba； infrared print； second derivative spectra； two-dimensional correlated spectra； sequential analysis of dual-indexes； cluster analysis

doi：10.4268/cjcmm20140920

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