宜昌市一种核桃黑斑病病原菌的分离及鉴定

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摘要：为明确引起宜昌市核桃黑斑病的病原菌，根据柯赫氏法则测定其致病性，通过形态学观察和rDNA-ITS序列分析鉴定病原菌。结果表明，引起宜昌市核桃黑斑病的病原菌为链格孢属链格孢

（Alternaria alternata）。

关键词：核桃黑斑病;分离鉴定;形态学观察;链格孢（Alternaria alternata）;宜昌市

中图分类号：S436.64         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）18-0055-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.013           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and identification of a pathogen of walnut black spot in Yichang city

WANG Peng-cheng1，WU Chu2，SUN Zhi1，PENG Xin3，HAN Yong-shi4，SUN Chang-cheng5，JIA Qie2

（1.Hubei Three Gorges Polytechnic， Yichang 443000，Hubei，China;2.College of Horticulture and Gardening，Yangtze University，Jingzhou 434000，Hubei，China;3.Guojiaba Town Forestry Station of Zigui County，Zigui 443621，Hubei，China;4.Zigui County Forestry Bureau，Zigui 443600，Hubei，China;5.Xiakou Town Agricultural Technology Service Center of Xingshan County，Xingshan 443701，Hubei，China）

Abstract： To identify the pathogen causing walnut black spot in Yichang city， the pathogenicity was determined according to Koch"s rule. And the pathogenic bacteria was identified by morphological characteristics and rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that Alternaria altenata was the pathogen causing walnut black spot in Yichang city.

Key words： walnut black spot; isolation and identification; morphological observation; Alternaria alternata; Yichang city

核桃黑斑病是一种世界性病害[1]，对该病害的研究报道较多[2-6]，普遍认为黑斑病具有潜伏期长、发病时间短、暴发性强等特点;主要为害叶片、嫩枝、幼果及花序。当为害叶片时，先在叶片上出现圆形或者不规则小褐斑，随着病情发展，病斑相连成片，最后叶片脱落;为害嫩枝时，在嫩枝上形成黑褐色长条形斑，稍凹陷，最终病斑扩展包围枝条而使上段枯死;花序感病后产生黑褐色水渍状病斑，造成落花;果实受害后果面上形成黑褐色小点，随着病情发展，病斑不断扩大并逐渐下陷、变黑，果实腐烂脱落;未脱落的受害果实干瘪皱缩，核壳、核仁变黑，失去食用价值。

目前宜昌市有近4.6×105 hm2核桃树[7]，当地林业部门把核桃生产作为头等大事来抓。2018年春在秭归县进行果树病害调查时发现核桃树上有疑似核桃黑斑病病害，初步统计病株率高达30%以上，且呈暴发之势。据当地果农反映，这种病害每年都会发生，且很严重，常规施药防治效果不理想，严重影响了当地核桃生产和果农的积极性。为有效控制和防治该病害蔓延，对病原进行了分离、致病性测定和rDNA-ITS鉴定，初步确定了该病原菌分类定位，期望为探索该病害的防治措施提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  样品采集  2018年5月分别从宜昌市秭归县郭家坝镇白云山村及烟灯堡村核桃种植基地采集具有典型黑斑病症状的当年生幼嫩枝条，分别放于自封生物标本袋中带回实验室，直接分离病原菌或置于冰箱冷藏保存。采集健康核桃叶片及幼嫩枝条用于回接试验，进行致病性检测。

1.1.2  试验试剂、仪器与设备  Taq DNA聚合酶、缓冲液体系均由TaKaRa公司提供，定制引物、基因组DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒均由上海Sangon公司提供。

普通光学显微镜，E100，日本Nikon公司;PCR仪，9700型，美国ABI公司;DNA测序仪，3730XL型，美国ABI公司。

1.2  方法

1.2.1  菌株分离纯化  参照方中达[8]的方法，将幼嫩枝条冲洗干净，自然风干，用消毒剪刀切取病健交界处约4.0 mm×4.0 mm的组织，放于75%乙醇中消毒10～15 s，再經2% NaClO表面消毒4 min，然后用无菌水漂洗3次，最后转至PDA平板上，置于25 ℃恒温连续光照条件下培养3～4 d，待菌落长出后，挑取菌落边缘形态比较单一的小块菌丝转接到新的PDA平板上培养，重复纯化2～3次后挑取形态比较单一的小块菌丝移至PDA斜面试管中，于25 ℃恒温连续光照培养4 d后置于4 ℃冰箱内贮存备用。

分离菌株的单孢纯化采用分生孢子稀释法。供试菌株在PDA培养基中25 ℃连续黑暗培养7 d，加无菌水2 mL，用灭菌棉签轻洗培养菌落，配制分生孢子悬浮液，然后用无菌水进行梯度稀释，直至普通光学显微镜10×40放大倍率视野中镜检到1～2个分生孢子为止;最后将孢子悬浮液均匀涂抹在PDA培养基平板上。2 d后，再挑取单个分生孢子萌发产生的单菌落，移至PDA斜面培养保存备用。

1.2.2  致病性试验  按照柯赫氏法则，选取新鲜且健康的核桃叶片和幼茎茎段，用75%乙醇表面消毒后再用无菌水冲洗2～3次，放入铺有湿润灭菌吸水纸的搪瓷盘中，摆放整齐。用直径5.0 mm的打孔器在PDA平板上活化培养5 d的菌落边缘打孔，然后将菌丝块接种到叶片上，用保鲜膜封盘，置于25 ℃恒溫、12 h光暗交替条件下保湿培养，设置3次重复，PDA作为空白对照。接种2 d后移去菌丝块，连续10 d观察发病情况并进行记录。若症状相同，则对发病组织进行再分离，分离得到与原始接种菌株培养特征一致的菌株则可确定为该病的病原菌。

1.3  病原菌形态鉴定

1.3.1  菌落培养性状观察  将直径5.0 mm的菌丝块接种到PDA平板上，在25 ℃恒温连续光照条件下培养，观察记录病原菌的菌落特征以及有无分生孢子产生。

1.3.2  产孢表型观察  参照张天宇[9]的方法，取滤纸剪成比载玻片小的长方形，将中心挖1 cm左右的小方孔，灭菌后用无菌水润湿放于无菌载玻片上。然后从活化5 d的菌落边缘挑取小块菌丝均匀涂于滤纸中央方孔边缘，再将载玻片置于铺有湿润滤纸的灭菌培养皿中，25 ℃恒温连续光照条件下培养2 d后取出载玻片，在光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗形态。

1.4  菌株rDNA-ITS分子鉴定

1.4.1  DNA提取和引物扩增  取无菌的玻璃纸平铺在凝固的PDA培养基表面。从活化5 d的菌落边缘打取直径6.0 mm菌丝块，置于玻璃纸上。25 ℃恒温光照条件下培养，5 d后收集菌落边缘新鲜菌丝。

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取DNA。取6 μL DNA琼脂糖凝胶液电泳检测，用英国Syngene G：BOX EF 2凝胶成像系统进行拍照。

采用真菌生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4对rDNA-ITS区域进行PCR扩增。

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

1.4.2  PCR反应体系与ITS序列分析  PCR反应体系总体积为50 μL，反应液组分为：10×PCR Buffer（含MgCl2）5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和ITS4（25 μmol/L）各1 μL，加ddH2O使总体积达到50 μL，在PTC-100 PCR扩增仪上扩增。扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反应结束后取6 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物委托深圳华大基因科技有限公司进行DNA纯化和测序。测序结构登录NCBI进行Blast比对。

2  结果与分析

2.1  病原菌菌落形态

将所采病样经过3次单菌落分离和纯化，获得1株真菌，编号为JF1。初期菌落生长较慢，菌丝绒毛状，白色，菌落近圆形，较整齐，随着菌落不断扩大，菌落颜色逐渐呈浅灰色或深灰色;气生菌丝致密厚实，无异味。翻转培养基观察，背面灰黑色至黑色，呈同心轮纹状（图1）。

2.2  菌种形态观察

取出载玻片在光学显微镜下观察，JF1菌丝单生或有分枝，有隔，有锁状联合。分生孢子梗链短、分枝较多，直立或弯曲;分生孢子黄褐色，倒棒状、倒梨形或椭圆形，脐部明显，具有若干横、纵隔膜，分隔处平滑或缢缩，顶部有鸟嘴状突起的喙，初步判断为链格孢属真菌（图2）。

2.3  菌株致病性确定

取菌丝块分别接种到活体核桃叶片和幼茎上，3 d后该菌在核桃茎干（图3a）和叶片（图3b）上开始出现病斑，继续培养，病斑不断扩大（图3b、图3c），持续观察10 d并记录症状变化情况，发现此症状与之前采样的核桃病症一致（图3）。

2.4  菌丝DNA提取及凝胶电泳检测

按试剂盒操作说明及相关方法从菌体中提取出基因组DNA，提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA条带清晰、较明亮，可以作为PCR反应的模板;以DNA为模板，ITS1、ITS4为引物，对rDNA-ITS区段PCR扩增，扩增片段大小约为562 bp。

2.5  rDNA-ITS序列分析

ITS序列长度为562 bp，提交GenBank数据库进行Blast比对，登录号为MF785102.1、JF439442.1、MH619630.1。其中，MF785102.1（Alternaria alternata）相似度达100%。进一步结合MEGA 7.0分子软件，以5种链格孢属种即链格孢（Alternaria alternata）、芦荟黑斑病菌（Alternaria aborescens）、空心莲子草黑斑病菌（Alternaria alternantherae）、人参黑斑病菌（Alternaria panax）和向日葵黑斑病菌（Alternaria helianthi）在GenBank已知的ITS序列为参照，采用邻接法构建系统发育树（图4）。结果表明，JF1菌株与4株Alternaria alternata（HQ257255、GU566303、GQ249171和AB470838）聚为一支，相似度为86%，链格孢属其他菌株所在分支按相似度不同与其并列。结合形态学特征，将其鉴定为Alternaria alternata。

3  讨论

链格孢属真菌是世界性分布的真菌，包括腐生、内生和致病性等种类[10]。据报道，95%以上的链格孢种类兼性寄生于植物上，代谢产物即毒素可导致受害植物产生各种症状，如黑斑病、褐斑病、茎枯病、赤星病等，严重影响作物的产量和品质，给农业生产带来巨大损失[11]。自从2002年Belisario等[12]在核桃树的病斑上分离到链格孢属真菌后，链格孢对核桃的危害开始引起人们关注;Hong等[13]认为有3种链格孢可侵染核桃，分别是链格孢、细极链格孢和树状链格孢;在致病过程方面，Moragrega等[14]认为链格孢属真菌既能够单独致病，又可与其他病原生物共同致病;曲文文等[15，16]在山东省也从核桃病斑中分离出了链格孢属真菌，认为链格孢是造成核桃黑斑病和顶端褐色坏死的主要病原菌。本试验在宜昌市也分离到链格孢属真菌，认为链格孢属真菌是造成宜昌市地区核桃黑斑病的主要病原菌之一。

参考文献：

[1] 陈善义，陶万强，王  合，等.北京地区核桃黑斑病病原菌的分离、致病性测定和16S rDNA序列分析[J].果树学报，2011，28（3）：469-473.

[2] 张永强，朱惠英，冯  强，等.核桃黑斑病病原研究与防治试验初报[J].甘肃林业科技，2004，29（2）：41-42.

[3] 阳金华，罗智勇，邓学基，等.鄂西北核桃主要病虫害调查及防治初探[J].湖北林业科技，2014，43（2）：32-34，81.

[4] 李海菊，郝新科，牛昉卿，等.核桃黑斑病发生与防治[J].河北果树，2004（5）：44-45.

[5] 李  侠.核桃黑斑病发生特点及防控措施[J].黑龙江农业科学，2014（10）：172.

[6] 宫永红.核桃细菌性黑斑病研究进展[J].北方果树，2012（6）：1-4.

[7] 黄友佳.宜昌市木本油料产业发展调查研究[J].绿色科技，2018（3）：183-185.

[8] 方中达.植病研究方法[M].第3版.北京：中国农业出版社，1998.

[9] 张天宇.中国真菌志 第十六卷 链格孢属[M].北京：科学出版社，2003.33-42.

[10] 张  荣，岳海梅，孙广宇.小孢子链格孢OPA2-1核苷酸序列分析及系统发育研究[J].菌物学报，2009，28（4）：553-557.

[11] 崔  迪，王继华，陈  捷，等.链格孢属真菌对农作物的危害[J].哈尔滨师范大学自然科学学报，2005，21（3）：87-91.

[12] BELISARIO A，MACCARONI M，CORAMUSI A，et al. First report of Alternaria species groups involved in disease complexes of hazelnut and walnut fruit[J].Plant disease，2004，88（4）：426.

[13] HONG S G，MACCARONI M，FIGULI P J，et al. Polyphasic classification of Alternaria isolated from hazelnut and walnut fruit in Europe[J].Mycological research，2006，110（11）：1290-1300.

[14] MORAGREGA C，ZAKTAN H. Apical necrosis of Persian （English） walnut （Juglans regia）：An update[J].Journal of plant pathology，2010，92（S1）：67-71.

[15] 曲文文，劉  霞，杨克强，等.山东省危害核桃的链格孢属真菌鉴定及其系统发育[J].植物保护学报，2012，39（2）：121-128.

[16] 曲文文，杨克强，刘会香，等.山东省核桃主要病害及其综合防治[J].植物保护，2011，37（2）：136-140.

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